免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種利用抗原與抗體之間的專一性為基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典研究方法。

原理

如果細(xì)胞內(nèi)兩蛋白（A、B）有直接或間接的相互作用時(shí)，那么在溫和的裂解條件下獲得的蛋白樣品中加入 A 蛋白的抗體將A蛋白沉淀下來(lái)，在細(xì)胞內(nèi)與A蛋白直接相互作用的B蛋白或與其間接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下來(lái)。使用western blot檢測(cè)沉淀中是否存在B或C蛋白來(lái)確定B或C蛋白與A蛋白的相互作用。

用途

1、檢測(cè)A、B蛋白在體內(nèi)是否相互結(jié)合??

2、分離與A蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；??

（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；??

（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。??

缺點(diǎn)：

（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；??

（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；??

（3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。

步驟
一

細(xì)胞的鋪板與轉(zhuǎn)染?

1、提前一晚將293T細(xì)胞鋪板至6 cm皿中，鋪板量以達(dá)到相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑要求為準(zhǔn)；??

2、用各實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑將以下質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染兩皿細(xì)胞：flag 空載+HA-B；flag-A+HA-B；每質(zhì)粒2微克。

二

免疫沉淀

1、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，每皿加入500 μL裂解液，收集細(xì)胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超聲破碎細(xì)胞；??

2、超聲好后，4℃，12,000 g，離心30分鐘，取400 μL上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作總蛋白并加入等體積的2Ⅹ loading buffer；??

3、將400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 μg flag抗體，4℃孵育 3-4 小時(shí)；??

4、4℃，2,000 rpm，離心3分鐘，去除未結(jié)合的液體，留下beads沉淀，用預(yù)冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分鐘；??

4、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer，和總蛋白一起在沸水中煮沸 15 分鐘。?

三

Western Blot 檢測(cè)

通過(guò) SDS-PAGE 分離樣品，利用全蛋白樣品作為對(duì)照，檢測(cè)flag-A和HA-B蛋白是否發(fā)生結(jié)合。

注意事項(xiàng)

1、對(duì)于內(nèi)源的Co-IP檢測(cè)應(yīng)該用10cm皿來(lái)培養(yǎng)目的細(xì)胞，并維持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)；??

2、如果該實(shí)驗(yàn)用于新蛋白的鑒定，應(yīng)注意抗體重鏈和輕鏈的影響；??

3、該實(shí)驗(yàn)不能確定蛋白之間的相互作用是直接還是間接的。

END