前言

近日，歐易生物合作客戶中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所馮英研究組合作在Advanced Science（IF 16.806）發(fā)表通過單細胞轉錄組測序揭示Myf5衍生細胞的異質性以及其缺失SRSF2后肌源性命運改變的相關結果，郭若晨博士為文章第一作者，上海營養(yǎng)與健康研究所馮英研究員，濟寧醫(yī)學院出生缺陷研究與轉化協(xié)同創(chuàng)新中心陳瑞蛟研究員為該論文的共同通訊作者。歐易生物提供了該項目的單細胞轉錄組測序和分析，文章特別致謝了歐易生物巴永兵和李煉在單細胞分析中提供的幫助。

下面我們一起學習這篇文章的具體內容。

材料：對照和SRSF2敲除小鼠胚胎分選Myf5+細胞

期刊：Advanced Science

發(fā)表時間：2022年4月23日

方法：歐易生物10× Genomics單細胞轉錄組測序

研究背景

肌肉祖細胞是通過形成表達一種或幾種肌源調節(jié)因子 (MRF) 的成肌細胞來決定其肌源命運。肌生成過程包括成肌細胞分化為單核肌細胞，然后融合形成多核肌纖維。MRFs由 Myf5、MyoD、Myog和Myf6 組成，它們在Pax3和Pax7的下游起作用，基因靶向研究表明，MyoD 和 Myf5 均是肌源性決定基因。前期研究表明剪接因子 SRSF2 是細胞存活的關鍵調節(jié)因子，然而SRSF2 是否參與成肌細胞增殖和肌生成仍不清楚。因此作者結合條件性敲除和譜系追蹤方法表明，缺乏SRSF2的Myf5-cre小鼠在出生時立即死亡，并且造成成肌細胞高水平凋亡，完全沒有成熟的肌纖維生成。突變的Myf5衍生細胞（tdtomato 陽性細胞）隨機分散在肌源性和非肌源性區(qū)域，表明骨骼肌分化所需的群落效應喪失。

單細胞 RNA 測序進一步表明 myf5 衍生細胞的高度異質性以及非肌原性細胞在沒有 SRSF2 的情況下以骨骼肌細胞為代價顯著增加，反映了細胞命運的改變，此外，差異基因表達分析表明，分化標志物 Myog 和 p21上調，并且 Pax7和Myf5在突變體與對照的分化擬時間期間的異常表達。

最后，SRSF2的敲低導致成肌細胞的早熟分化并導致祖細胞的耗盡?？傊@些結果表明SRSF2 是 Myf5 衍生細胞正確響應位置線索并決定其肌源性命運的重要調節(jié)因子。在成肌細胞中敲降SRSF2造成高水平的凋亡和分化缺陷。

研究內容解析

SRSF2對成肌細胞的增殖和分化的功能分析

為了探討SRSF2在成肌分化中的作用，作者從以下幾個方面進行了體內外實驗驗證：

（1）首先從E16.5野生型小鼠中分離出原代成肌細胞并對Pax7、Myf5、MyoD和SRSF2進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)SRSF2在大多數(shù)Pax7陽性和Myf5陽性成肌細胞以及約80% MyoD陽性細胞中表達。體外誘導成肌細胞分化后進行RT-qPCR分析表SRSF2在分化后mRNA水平急劇下降，與Myf5和MyoD的表達模式高度相似。分化后的C2C12細胞中SRSF2的蛋白質水平同樣降低，表達分化標志物Myog的細胞也顯示出SRSF2的微弱信號。轉染C2C12細胞和成肌細胞SRSF2特異的siRNAs后誘導分化，對Myog和肌球蛋白重鏈 (MHC) 進行免疫染色顯示，SRSF2的敲低顯著損害了C2C12細胞和成肌細胞的成肌分化。與對照 siRNA 相比，siSRSF2 顯著降低了增殖標志物 Ki67 的強度并增加了 p21 信號，蛋白質印跡 (WB) 分析進一步證明SRSF2敲低導致MyoD依賴性基因的激活，E2F1本身和E2F1依賴的細胞周期基因如Ccnb1被關閉，磷酸化pRb (p-pRb)水平下降。這些結果表明SRSF2在體外調節(jié)成肌細胞的增殖和分化中起關鍵作用。

（2）為了進一步探究SRSF2在成肌中的作用，作者構建了Srsf2基因表達缺陷SRSF2f/f/Myf5-Cre小鼠（MKO）。MKO新出生小鼠很快死亡，在胚胎第19天骨骼肌的組織學檢查發(fā)現(xiàn)存在嚴重的分化缺陷，后肢肌肉質量顯著減少，完全沒有成熟纖維，后肢和肋間有高水平的細胞凋亡。E15前肢切片免疫染色顯示， Pax7和Myf5表達的成肌前體細胞/成肌細胞在MKO胚胎中顯著減少，并且存在大量凋亡細胞。這些結果表明Srsf2基因突變的肌肉細胞在胚胎肌發(fā)生過程中經(jīng)歷了異常的細胞凋亡。

（3）為了追蹤Myf5衍生細胞的肌源性命運，作者構建了雜交鼠(Het:SRSF2f/W/Myf5-cre)，其可以通過tdTomato (tdT)專門標記 Myf5 表達的細胞。分別在E12.5、E13.5和E14.5制備對照和MKO/tdT小鼠的四肢橫切面，tdT染色顯示大部分tdT+細胞（Myf5衍生細胞）位于預期的肌肉區(qū)域，排列成同質的連貫組，與相鄰的非肌肉細胞有明顯的界限，這被稱為肌肉發(fā)育過程中的群落效應，會激活細胞群中的肌肉基因表達，然而，這種效應在E13.5和E14.5突變小鼠中完全被破壞。對照小鼠中的Myf5衍生細胞顯示出正常的肌原性，分化為功能性肌纖維，相反，MKO小鼠中的大多數(shù)tdT+細胞無法通過正常的發(fā)育程序獲得肌源性命運。

（4）接下來，作者通過對Ki67進行免疫熒光染色來分析tdT+細胞的增殖率。在E14.5小鼠中，發(fā)現(xiàn)到對照組中Ki67/tdT雙陽性細胞的數(shù)量與突變體相比減少了5倍，同時在突變小鼠中檢測到大量tdT+凋亡細胞，但在對照小鼠中僅存在少數(shù)凋亡細胞。更重要的是，在E13.5和E14.5突變小鼠中觀察到Pax7+細胞大量減少，這與MHC陽性纖維顯著減少同時發(fā)生。隨著年齡的增長，在 E14.5肢體中檢測到的雙陽性細胞逐漸減少。顯然這些結果表明MPC經(jīng)歷了加速耗盡，可能是由于tdT+細胞的分散分布和凋亡增加導致。

圖1 | SRSF2對體外成肌細胞的增殖和分化至關重要

scRNA-seq揭示tdT+細胞的不同亞群并確定了突變小鼠中耗竭的骨骼肌細胞群

為了表征SRSF2突變前后的Myf5衍生細胞在骨骼肌發(fā)育中的細胞命運和動力學，作者從E14 Het/tdT和MKO/tdT胚胎中分離出單核細胞，并通過流式細胞儀分選tdT+細胞進行scRNA-seq（圖 2A），流式的結果也表明突變組tdT+細胞比例的顯著降低（7.43% vs28.6%）。測序結果質控后，總共9439個對照組細胞和18226個MKO組細胞進行下游分析。

降維聚類后t-SNE顯示共不同轉錄模式的19個細胞分群，基于細胞已知的細胞類型特異marker和細胞群相關性分析，作者將19個分群鑒定為共10種不同的細胞類型（圖 2B）。Cluster 4 (C4) 和 C8 表達骨骼肌細胞marker，例如 Pax7、Myf5、Myod1、Myog和Myh3,其余9種細胞類型為非肌源細胞，分別為由C1、C3、C5 和C11組成的間充質細胞（Mesen）高表達Pdgfra和Dcn；軟骨細胞（Chon:C2）高表達Chad5和Sox5；成骨細胞（Osteo: C10）達Sp7；神經(jīng)細胞（Neu：C6、C15和C18）表達Dcx和Tubb3；施旺細胞（Sch: C10）表達Cdh19，內皮細胞（Endo：C7和C9）高表達Pecam1和Kdr；免疫細胞（Immu：C14、C17和C19）表達Srgn；上皮細胞（Epi：C16）表達Krt5。Mki67主要在骨骼肌和間充質細胞表達（圖2C）。這些結果表明發(fā)育過程中Myf5衍生細胞的高度異質性。

不同細胞類型的占比分析發(fā)現(xiàn)，在對照組中，大約21.44%的tdT+細胞為肌原性細胞，但在突變小鼠中只有一小部分細胞 (≈1.43%) 屬于骨骼肌細胞，此外，間充質細胞在對照或突變小鼠中占據(jù)了大約49%的Myf5衍生細胞，但它們在兩個樣本之間并不完全重疊（圖 2D）。這些結果表明SRSF2的缺失顯著改變了Myf5衍生細胞的細胞比例。

圖2 | ?scRNA-seq表明Myf5衍生細胞的不同細胞譜系

骨骼肌細胞群體的軌跡分析揭示了在SRSF2缺失的情況下成肌細胞的異常增殖和分化

對骨骼肌細胞的再聚類分析共鑒定出6個不同的骨骼肌亞群，標記為sC1到sC6（圖 3A）。sC1細胞表達高水平的Pax7、Myf5和Myod1以及Mki67，定義為活化的成肌細胞；sC2細胞的活化程度低于sC1細胞，因為它們表達的這些標志物水平相對較低；基于分化和成熟纖維標記如p21、Myog和Myh3的表達，將sC3、sC4和sC6鑒定為已分化群體，sC5 細胞，同時表達激活和分化marker，可能代表中間狀態(tài)（圖 3B和C）。同時也發(fā)現(xiàn)與對照相比，突變體中已分化細胞的比例增加，活化細胞的比例降低（圖 3D）。使用Monocle2分析成肌過程中的細胞轉變，發(fā)現(xiàn)sC1和sC2在時間起點（pre-b），一小部分在時序分支b2。已分化細胞定位朝向或在主分支（b1）末端和小分支b3，sC5 細胞沒有表現(xiàn)出空間偏差。盡管突變細胞數(shù)量很少，但它們比對照細胞更傾向于向b1分布（圖 3E和F）。在時間開始時觀察到Pax7、Myf5和Myod1的高表達，而p21僅限于b1結束，靜止marker Gpx3在b2結束時富集，同時Myod1完全丟失，這些結果表明活化的成肌細胞可以進入分化和靜止期兩種狀態(tài)。

圖3 | 擬時序分析γδ T細胞發(fā)育軌跡

作者隨后排除了部分靜止細胞，主要分析分化過程中基因表達的動態(tài)變化（圖 4A）。高變基因分析發(fā)現(xiàn)下調基因富集MPC marker、核小體組裝、細胞周期和DNA復制等，如Pax7、Myf5、E2f1、Kif11、Tfam、Mki6、Esco2，上調基因主要與骨骼肌收縮和纖維發(fā)育有關，例如Myog、Ckm和Myh3（圖 4B）。兩組的表達分析發(fā)現(xiàn)，時間順序上與對照相比，突變組Myf5的表達在早期上調，伴隨著中Myog和Cdkn1a水平的增加，然而Pax7首先下調然后快速上調（圖 4C），此外，增殖相關基因Tfam、Rad21、Ncapd2和E2F1 均失調，而糖酵解相關基因Eno3、Pgam2、Aldoa和Ldha在突變體中均上調（圖 4D和E）。一致地，與對照組相比，突變組細胞骨架相關基因Col1a1、Col3a1、Postn和Dag1下調，壓力基因ATF3、Fos,、Hspa1a和Hspa1b顯著上調（圖 4F和G）。這些結果表明SRSF2缺失的情況下，成肌細胞表現(xiàn)出異常的增殖和分化。

圖4 | MKO/tdT和Het/tdT組擬時序高變基因分析

突變小鼠和成肌細胞中觀察到祖細胞的早熟分化和缺失

為了驗證scRNA-seq的數(shù)據(jù)，作者首先Pax7和DNA損傷標記物??H2AX進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)突變組肌肉Pax7+細胞的數(shù)量大大下降，但Pax7+/??H2A+細胞數(shù)量是對照組的10倍以上，表明與對照細胞相比，突變的Pax7+細胞更容易死亡（圖 5A）。另外，突變組p21的水平顯著增加，Myf5+細胞在KO小鼠中廣泛地擴增（圖 5B和C）。在原代成肌細胞轉染siSRSF后染色結果發(fā)現(xiàn)，在SRSF2敲低的細胞中觀察到大量Myog+成肌細胞和MHC+肌管，表明SRSF2敲低導致早熟成肌分化，并且分化能力下降，分化的肌管以及未分化的成肌細胞呈現(xiàn)高凋亡率（圖 5 D和E），WB結果同樣也證實了上述結果（圖 5F）。總之，這些結果表明SRSF2敲低會導致原代成肌細胞的早熟分化和細胞凋亡。

圖5?| SRSF2的缺失導致成肌細胞異常增殖、耗竭和早熟分化

由于scRNA-seq數(shù)據(jù)表明p21在突變組肌肉中顯著表達上調，作者后續(xù)對p21基因進行siRNA干擾。結果發(fā)現(xiàn)與siSRSF2轉染的細胞相比，p21的下調導致雙siRNA（siSRSF2和sip21）轉染的細胞中Ki67陽性增加，但對僅用sip21轉染的細胞的增殖沒有顯著影響(圖 6A和B)。此外，在雙重敲低細胞中觀察到Myog和MHC染色減少，表明與SRSF2敲低細胞相比，p21敲低顯著挽救了由SRSF2下調誘導的早熟分化(圖 6C和D)。這些結果表明在敲除SRSF2會激活原代成肌細胞中p21依賴性途徑。

圖6?| 敲低p21可以抵消由SRSF2缺失引起的增殖和分化缺陷

研究結論

單細胞轉錄組測序和實驗數(shù)據(jù)表明Myf5衍生的細胞在肌肉組織細胞譜系的占比比先前描述的要高，并且SRSF2是胚胎肌生成的關鍵調節(jié)因子。SRSF2調節(jié)Myf5細胞進入生肌程序，并通過防止早熟分化和細胞凋亡來確保其存活。

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END本文系歐易生物原創(chuàng)