過去的20年間，治療性雙特異性抗體（雙抗）得到了長足發(fā)展?！半p抗家族”其結(jié)構(gòu)形式已多達(dá)100種，這其中包括不同種屬之間的組合。最簡單的雙抗分子即包含兩個可分別特異性結(jié)合抗原位點的小分子（抗體重鏈，輕鏈可變區(qū)序列）。還有IgG樣分子以及由可以結(jié)合不同的抗原位點的大分子復(fù)合體形成的二聚體分子。復(fù)雜分子設(shè)計和基因工程的應(yīng)用已經(jīng)解決了許多關(guān)于雙抗制備的技術(shù)難題，比如：穩(wěn)定性、溶解性以及其它關(guān)于成藥性抗體分子的相關(guān)參數(shù)。這些參數(shù)總結(jié)起來講即抗體分子的可開發(fā)性。另外，不同的產(chǎn)品開發(fā)目標(biāo)，決定著所產(chǎn)生的雙特異性抗體的特征，指導(dǎo)著所需要形成的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)形式，以及開發(fā)過程中可能需要改變它們的結(jié)合區(qū)域的分子大小、排列、價數(shù)、柔韌性和幾何結(jié)構(gòu)。因此，不存在最佳的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)，也不存在某個結(jié)構(gòu)形式普遍適用于任何雙特異性抗體分子。相反，雙特異性抗體結(jié)構(gòu)形式的多樣性才是寶貴的資源，才有可能成就治療性雙特異性抗體的百花齊放。本文將綜合描述絕大部分雙特異性抗體的形式。

前言

雙特異性抗體廣泛用于診斷、影像、疾病預(yù)防和治療。起初，雙特異性抗體在治療領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在效應(yīng)細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞的重定位，這其中就包括T細(xì)胞的重定位，這一點，靠傳統(tǒng)的單克隆抗體是無法實現(xiàn)的。過去的幾十年里，建立了基于雙特異性抗體的多種治療策略。除了重定位的效應(yīng)分子，細(xì)胞和基因治療載體，雙靶向，前靶向策略，半衰期延長，以及跨越生物屏障比如血腦屏障的方法已經(jīng)被開發(fā)了出來。雙特異性抗體被認(rèn)為是眾多適應(yīng)癥中最具潛力的治療手段，包括癌癥，慢性炎癥反應(yīng)，自身免疫性疾病，神經(jīng)退行性疾病，出血性疾病，感染等疾病。這些分子的使用已經(jīng)有廣泛的報道。本文將集中描述產(chǎn)生雙特異性抗體的眾多結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的策略。雙特異性抗體無疑是發(fā)展最快的領(lǐng)域。隨著新的結(jié)構(gòu)形式不斷涌現(xiàn)，緊跟腳步實在是一項挑戰(zhàn)性的任務(wù)，本文不可能面面俱到，也不可能囊括現(xiàn)存所有的雙抗結(jié)構(gòu)樣式。對雙抗結(jié)構(gòu)樣式的探索，相關(guān)知識的學(xué)習(xí)不能一蹴而就，任重道遠(yuǎn)。

雙特異抗體的分類

絕大多數(shù)天然抗體是針對同一抗原結(jié)合位點二價或者多價分子。IgG4分子由于其鉸鏈區(qū)的不穩(wěn)定，通常會發(fā)生Fab臂交換的現(xiàn)象。這是一個隨機(jī)的進(jìn)程，該過程產(chǎn)生針對兩個特異性位點的雙價分子。而雙特異性抗體是針對兩個明確的特異位點產(chǎn)生的人工分子，通常在自然狀態(tài)下是不能發(fā)生的。這就意味著需要借助生物化學(xué)，分子以及遺傳學(xué)方面的知識，經(jīng)過改造才能實現(xiàn)。最為古老的方法是化學(xué)偶聯(lián)的方法將兩個抗體分子，或抗體分子片段強(qiáng)拉硬拽的連接了起來，本文不做贅述(CovX-Bodies)圖2-1。另外，通過融合兩種雜交瘤細(xì)胞，在新的雜交-雜交瘤細(xì)胞里產(chǎn)生含有兩條不同重鏈，兩條不同的輕鏈雙特異性IgG分子，如圖2-1，同時也產(chǎn)生一些非功能分子副產(chǎn)物。

產(chǎn)生IgG樣的雙特異性分子其難點在于抗原結(jié)合位點由輕鏈和重鏈的可變區(qū)序列（VL,VH）共同組成。一個雙特異性抗體需要兩條不同的重鏈，兩條不同的輕鏈以非對稱的形式組成，并至少含有兩個Fv區(qū)。兩條不同重鏈，兩條不同的輕鏈自由組合的結(jié)果多達(dá)16種，產(chǎn)生10種不同的分子結(jié)構(gòu)，卻只有一種想要的雙特異型結(jié)構(gòu)。其余都是一些非功能性分子或者單抗分子。對于雙特異性抗體來說，直接，有力的完成重鏈與重鏈，重鏈與輕鏈的組裝，的確是一大條挑戰(zhàn)。二十多年來，人們通過各種策略，一致致力于解決這個問題。

重組雙特異性抗體可根據(jù)結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行分類。一大主要的區(qū)別在于雙抗分子是否含有Fc區(qū)。不含F(xiàn)c區(qū)的雙抗分子缺少Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，例如抗體依賴的細(xì)胞毒性作用（ADCC），抗體依賴的細(xì)胞吞噬作用（ADCP）,補(bǔ)體的固定，F(xiàn)cRn介導(dǎo)的抗體循環(huán)（將大大延長IgG的半衰期）。含有Fc區(qū)的雙特異性抗體可進(jìn)一步分為IgG樣的分子以及額外包含其它結(jié)合位點的IgG樣衍生物。不同的雙特異性分子又可根據(jù)對稱性分為對稱結(jié)構(gòu)和非對稱結(jié)構(gòu)。例如，多數(shù)IgG樣雙特異性分子為非對稱的，而IgG樣融合蛋白在組成上通常是對稱的（圖1）。進(jìn)一步的可以根據(jù)結(jié)合位點數(shù)目區(qū)分它們的特點。在一簡單的設(shè)計中，像IgG分子一樣，雙特異性抗體包含兩個結(jié)合位點可以針對各自的抗原表位即“1+1”形式，是雙價的。在IgG的基礎(chǔ)上，給每一條鏈增加額外的結(jié)合位點形成4價分子，即“2+2”形式。其它的形式包括產(chǎn)生“1+2”或者“1+3”等分子結(jié)構(gòu)，擁有1個結(jié)合位點結(jié)合一種抗原的一個表位，和2或3個結(jié)合位點分別結(jié)合另外的抗原?？梢酝ㄟ^增加價位，或者增加特異性產(chǎn)生3或4價分子。另外，產(chǎn)生雙特異性抗體鏈的數(shù)量可以多樣化。因此，典型的IgG樣雙特異性抗體需要表達(dá)四條不同的多肽鏈，但是在某些結(jié)構(gòu)中僅需要3,2,甚至一條鏈就可以實現(xiàn)。

圖1?模塊及產(chǎn)生同源或者異源二聚體分子實例示意圖

一個廣泛的囊括了不同模塊 ———抗原結(jié)合分子，可以用于產(chǎn)生同源或異源二聚體雙特異性抗體分子的示意圖（圖1），可根據(jù)設(shè)計靶點分子，價位，分子大小，靈活性，藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性等需求來設(shè)計雙特異性抗體。

圖2.雙特異性抗體分子結(jié)構(gòu)總覽

缺少Fc的雙特異性抗體形式

串聯(lián)連接單鏈可變區(qū)片段（scFv2,taFv）和三體

最簡單的雙特異性抗體，由兩種抗體的抗原結(jié)合片段構(gòu)成。單鏈可變區(qū)片段scFv形式源自VH,VL,代表著最小的抗原結(jié)合單位，是最為廣泛的雙特異性抗體構(gòu)成元件。由于scFv的構(gòu)象，雙特異性抗體可以通過將兩條scFv用連接子連接而成。因此，這些分子是雙價的，對于每一個抗原來說又是單價的，其典型的分子量在50-60KDa。

首次關(guān)于串聯(lián)scFv分子的報道要追溯到20年前（如圖2-3）。在這項研究中，兩個scFv通過27個氨基酸的螺旋連接子或柔性連接子（?木霉菌脫氫酶I）連接融合表達(dá)。自此以后，許多串聯(lián)表達(dá)的scFv結(jié)構(gòu)相繼報道。原則上，兩個串聯(lián)的scFv形成taFvs，其排列順序是明確的（VH-VL或VL-VH）,連接子的長度和組成影響著taFvs的折疊，穩(wěn)定性，以及與抗原的結(jié)合。各種各樣的連接子可以用來連接兩個scFv, 最短的連接子如Ala 3,?通過噬菌體展示篩選到的親水性連接子，富含Gly-Ser的連接子，采用螺旋構(gòu)象的連接子以及一些源于免疫球蛋白和非免疫球蛋白的分子。由5和15個氨基酸長的Gly-Ser連接子，連接兩個分別針對CD3和CD19有活性的scFv片段，構(gòu)成的連接子不同的兩種雙特異性抗體，體外實驗顯示二者之間在生物活性上沒有差異，這就意味著短的連接子連接的scFv有足夠的柔韌性，可以募集T細(xì)胞并交聯(lián)到腫瘤細(xì)胞展示的抗原。

串聯(lián)scFv的雙特異性抗體廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療，重定向T細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)細(xì)胞。這一結(jié)構(gòu)形成重定向T細(xì)胞的雙特異性抗體分子(BiTE)，第一款(BiTE)雙特異性抗體分子(Blincyto, blinatumomab)獲準(zhǔn)用于治療費城染色體陰性前體B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-cellALL)患者,blinatumomab由CD19抗體的scFv按VL-VH方向通過G 4 S連接子連接著以 VH-VL 排列的CD3抗體scFv。由于分子量小，BiTE分子可以快速的被清除，半衰期僅1.25h。該抗體治療需要用注射泵以恒定的流速持續(xù)靜脈注射，治療至少持續(xù)4周。

串聯(lián)scFv雙特異性抗體包括針對CD16 的scFv,重定向NK細(xì)胞的雙特異性抗體（BiKEs）。在一項研究中，抗CD16 scFv由源于人肌肉醛縮酶的20個氨基酸連接子連接抗CD133抗體scFv用于結(jié)腸癌治療。

這種模塊化方式的構(gòu)建特性允許拓展串聯(lián)scFv，例如添加更多的scFv。即應(yīng)用于產(chǎn)生三價抗體，雙特異性分子（三體）含有兩個CD19結(jié)合位點和一個CD16結(jié)合位點重定向與NK細(xì)胞（如圖2-3）。該三體中所有scFv單位，可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VH和VL結(jié)構(gòu)域，所有連接方向為VL-VH，通過 20個氨基酸的(G4 S )4連接子連接而成。該方式允許產(chǎn)生三特異性分子，就如同現(xiàn)實的三價分子，三特異性三體分子針對CD16,CD19,CD33,多靶向針對混合白血病細(xì)胞表面的不同抗原，重定向NK細(xì)胞到癌細(xì)胞周圍。

單個scFv模塊的穩(wěn)定性是一個普遍關(guān)注的問題，因為分子間的相互作用只發(fā)生在VH-VL界面之間，它們之間沒有共價鍵。串聯(lián)scFv穩(wěn)定性的改善需要在scFv單元的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域引入二硫鍵（在VH 44位和VL 的100位引入Cys）產(chǎn)生二硫鍵穩(wěn)定的scFv(dsFv,dssFv)。這種方法也可以引入三價甚至多價抗體中，穩(wěn)定1個，2個，甚至所有的scFv單元。另一種方法是在VH和VL結(jié)構(gòu)域中引入氫鍵（VH39,VL38）以替代靠靜電引力維持的VH-VL相互作用。

雙特異性結(jié)構(gòu)域抗體融合蛋白

串聯(lián)排列抗原結(jié)合位點，單結(jié)構(gòu)域抗體例如VH或VL結(jié)構(gòu)域，VHH,VNAR和納米單抗，都可以用來構(gòu)建雙特異性抗體分子，而且，這些方法也可以用于支架蛋白，產(chǎn)生抗體樣蛋白（如圖2-3）。包含2個或更多個單結(jié)構(gòu)域抗體將在一個或多個特異性分子中，產(chǎn)生雙價，三價或更多價分子。例如兩個VHH結(jié)構(gòu)域通過一個長的鉸鏈區(qū)序列融合起來，該連接子源自美洲駝IgG2a鉸鏈區(qū)上游不易被蛋白酶降解的序列或柔性序列。另一個例子是柔性連接子將兩個鯊魚免疫球蛋白新抗原受體（VNAR）連接起來。該連接子由天然鯊魚免疫球蛋白新抗原受體鉸鏈區(qū)氨基酸組成（PGVQPSP），隨后是柔性GGGGSG序列。在另一項研究中兩個人源單域抗體，結(jié)合為雙特異性抗體DAbs,該雙特異性抗體靶向白色念球菌的兩種抗原。例如一個實例中產(chǎn)生的四價抗體，由連接子將四個VHH連接成雙特異性VHH融合蛋白，兩個VHH靶向TcdA,兩個VHH靶向TcdB,(這兩種抗原來自艱難梭菌屬)，在四個VHH分子之間由三個柔性連接子(G3S)4連接。體內(nèi)外實驗顯示該融合蛋白都加強(qiáng)了中和作用。納米抗體可以結(jié)合形成三價，雙特異性分子，再連接一個血清白蛋白以延長血清半衰期，另兩個位點靶向目標(biāo)抗原。一個針對IL-6R的納米抗體融合蛋白目前已進(jìn)入臨床實驗。這里有一個由三個納米抗體通過兩個GGGGSGGS連接子連接的融合蛋白。類似的方法，三價雙特異性VHH融合蛋白用于口蹄疫病毒治療，融合豬免疫球蛋白，顯著增強(qiáng)了融合蛋白的體內(nèi)半衰期。

雙體和雙體衍生物

雙體（Db）是由兩條鏈構(gòu)成的雙價分子，每條鏈包含一個VH結(jié)構(gòu)域和一個VL結(jié)構(gòu)域，兩條鏈上的VH和VL來自兩個不同抗體。在雙體形式中，兩個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域通過5個氨基酸殘基的短連接子連接，例如GGGGS。實質(zhì)上由于其連接子長度，較抗原結(jié)合位點形成的scFv鏈內(nèi)組裝所需要的連接子短，兩條鏈以從頭對尾的方向二聚化產(chǎn)生緊湊的分子，分子結(jié)構(gòu)類似于串聯(lián)的scFv,分子量約50Kda。在同一個細(xì)胞中表達(dá)兩條鏈，一條為VHA-VLB構(gòu)型，另一條鏈為VHB-VLA構(gòu)型（A和B代表兩種不同的特異分子）或者以VLA-VHB和VLB-VHA構(gòu)型產(chǎn)生可變區(qū)正確配對的異二聚化的雙特異性抗體（圖2-3）。雙特異性抗體已經(jīng)被用于重定向效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)分子，以及其他用途。比如抗表皮生長因子抗體EGFR與抗胰島素樣生長因子抗體IGF-R構(gòu)成的雙特異性抗體，結(jié)果顯示，選擇優(yōu)化的VH/VL排列方向在一定程度上影響著抗體與抗原的結(jié)合。除了結(jié)構(gòu)域的順序，連接子的長度，組成都需要經(jīng)過優(yōu)化。研究表明抗神經(jīng)氨酸酶scFv在以VH-VL,VL-VH兩種取向，連接子為3-12個G-S的連接子連接的情況下易于組合成雙體，當(dāng)連接子更短的時候?qū)a(chǎn)生三聚體，四聚體的組裝。

關(guān)于雙特異性雙體分子的一個問題是,兩條不同的鏈,VHA-VLB和VHB-VLA共同表達(dá)于一個細(xì)胞，容易產(chǎn)生非正確配對的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（VHA/VLB,VHB/VLA）。進(jìn)一步的問題是由于兩條鏈之間并非共價鍵連接，穩(wěn)定性較差。一種解決方法是在配對的VH-VL結(jié)構(gòu)域(dsDb)之間引入二硫鍵（圖2-3）該方法可以增加穩(wěn)定性。該方法進(jìn)一步改進(jìn)是在兩對VH-VL配對中都引入二硫鍵，另外在VHA-VLB連接中僅用長度為10個氨基酸的連接子，而VHB和VLA分開來單獨表達(dá)，于是產(chǎn)生了含有三條多肽鏈的dsFv-dsFv’結(jié)構(gòu)（圖2-3）.另外也可以嘗試新的模型用于不同的結(jié)構(gòu)域形成異二聚體。例如，形成knob-into-hole雙特異性雙體（圖2-3）.該方法的一個實例是抗表皮生長因子受體HER2與抗CD3抗體構(gòu)成的雙特異性雙體。該結(jié)構(gòu)是在一個配對的VH與VL之間不同的位點引入突變，顯著增加了異二聚體的形成。當(dāng)然，在某些情況下，這樣的突變形式容易影響抗體與抗原的結(jié)合，這就意味突變位點要慎重選擇。

另一種可替換的方案是以形成單鏈的形式，改變形成異二聚體雙體的方法，將形成雙體的第一條鏈(VHA-VLB or VLA-VHB)，和第二條鏈(VHB-VLA or VLB-VHA)通過15個氨基酸的柔性連接子連接起來。這一單鏈形式的雙體分子中(scDbs)，長連接子保證了兩條鏈的正確組裝，在不改變抗原結(jié)合活性的前提下，提高了分子的穩(wěn)定性。scDb由四個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域通過三個連接子連接而成，兩個側(cè)翼連接子和一個中間連接子。后來其他scFv中的組裝中也用到了該連接子。已經(jīng)有研究者借助噬菌體文庫篩選，就連接子在長度和氨基酸組成上進(jìn)行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，在單鏈雙體形成過程中，兩個側(cè)翼的連接子以2-6個氨基酸長度最為適宜，中間的連接子以＞13個氨基酸更為適宜。其它適宜作中間連接子包括源于核蛋白La C端結(jié)構(gòu)域中的α螺旋序列。

單鏈雙體結(jié)構(gòu)scDb有時候也用作產(chǎn)生四價雙特異性抗體。這可以通過縮短中間連接子使得兩個scDb多肽鏈形成頭對尾的二聚體分子，串聯(lián)雙體(TandAb)(圖2-3)其分子量大約在100KDa,兩倍于scDb的分子量。在以CD19和CD3抗體組成的TandAb中，中間連接子用6-12個氨基酸。這一產(chǎn)生TandAb四價體的方法也被成功用于重定向與NK細(xì)胞的CCD16A抗體和CD33抗體組成的TandAb四價抗體上。在該構(gòu)造中用了由9個氨基酸，包含3個GGS重復(fù)的三個連接子中。該TandAb（AFM13）已經(jīng)用于復(fù)發(fā)或難治性霍奇金淋巴瘤治療的臨床1期試驗中。在另一TandAb構(gòu)造中，針對CD33和CD3的抗體，三個連接子分別用了GGSG, GGSGG, GGSGGS。

關(guān)于雙體的形成，另一種方式是在兩條鏈得C端加上Cys。通過該方法形成的雙體稱作雙親和重定向蛋白(DART)（圖2-3）.該結(jié)構(gòu)的第一個實例是針對CD32B和CD16兩個分子。每條鏈的VL結(jié)構(gòu)域與VH結(jié)構(gòu)域之間通過8個氨基酸GGGSGGGG連接，第一鏈的C端以源于IgG1鉸鏈區(qū)上游序列FNRGEC或LGGC進(jìn)行延伸，第二鏈的C末端以VEPKEC（源于κ鏈C端）或LGGC進(jìn)行延伸。所有修飾產(chǎn)生穩(wěn)定的，二硫鍵連接的分子，并且保持著相應(yīng)的抗原結(jié)合活性。該結(jié)構(gòu)也用于構(gòu)成CD19 X CD3雙特異性抗體。

運用雙體形式，產(chǎn)生四價雙特異性分子之前已經(jīng)描述過。在一個實例中，額外的一個VHA融合在了VLA-VHB的N端，而且與多肽鏈VLA-VHA-VHA共表達(dá)，運用富含GS的16個氨基酸殘基連接額外的可變區(qū)到雙體核心上（圖2-3）.在該研究中，四價雙特異性形式由VHA-VHA-VHB和VLB-VLA-VLA構(gòu)成，所有的VH結(jié)構(gòu)域在一條鏈上，所有的輕鏈VL結(jié)構(gòu)與在另一條鏈上呈現(xiàn)。在每一條鏈前兩個結(jié)構(gòu)域C端分別通過16,14個氨基酸的連接子連接，而前兩個結(jié)構(gòu)域之間通過GGGGS連接子鏈接。兩種三頭分子（BS6,BS8）都可以在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生有活性的分子，可能用于向腫瘤細(xì)胞遞送放射性標(biāo)記的二價半抗原。

Fab融合蛋白

Fc缺乏的雙特異性抗體也可以以Fab為基礎(chǔ)構(gòu)建，以及與其他單元融合。Fabs是由一條輕鏈和一條重鏈片段Fd組成的,并以此產(chǎn)生雙價，雙特異性分子。也可以通過在輕鏈,或者Fd的C端融合scFv,產(chǎn)生三價，雙特異，三特異融合蛋白(bibody Fab-L-scFv, Fab-HscFv),甚至是在兩條鏈的C端都融合scFv,產(chǎn)生三體(tribody, Fab-(scFv)2)（圖2-5）。在另一個例子中Fd鏈包含5個鉸鏈區(qū)上游氨基酸EPSGP，scFv通過DVPSGPG或(G4S)3連接子融合在L和Fd鏈的C端。這項研究表明Fab中的VH和VL結(jié)構(gòu)域極大增強(qiáng)了CH1-CL - 介導(dǎo)的異二聚化和分泌。?所有形式在雙特異性結(jié)合中都是完全有效的，被描述為在生理條件下具有低聚集和穩(wěn)定的傾向。對于其他scFv融合蛋白，將scFv連接于L鏈或Fd鏈的連接子，以及L鏈，F(xiàn)d鏈上，以及scFv上供連接子連接的結(jié)構(gòu)域順序都可以用來調(diào)整功能性分子柔韌性。例如，三價雙特異性Fab-scFv 和 Fab(scFv)2融合蛋白已經(jīng)用于針對CD19和CD16的抗體。在這里，scFv使用VL-VH的順序，該scFv含有結(jié)構(gòu)域間二硫鍵，起穩(wěn)定作用，而且通過GVPGGS連接子融合在Fab部分。在另一個例子中，借助二硫鍵穩(wěn)定的scFv的通過(G4S)n連接子融合到Fab產(chǎn)生單價的針對cMET的結(jié)合。在Fab額外融合一個或兩個額外的結(jié)合位點產(chǎn)生雙價，三價的分子。拓展Fab部分到鉸鏈區(qū)將產(chǎn)生四價的F(ab’)2-scFv融合蛋白，以對稱形式共價連接在鉸鏈區(qū)（圖2-6），如抗右旋糖酐/丹酰雙特異性抗體。通常，該方法還可以用于融合單結(jié)構(gòu)域抗體或支架蛋白到Fab上，例如產(chǎn)生的Fab-H-VHH融合蛋白靶向HER2和CD16.

Fabs也可以通過在其C端借助柔性連接多肽(替代鉸鏈區(qū))連接產(chǎn)生強(qiáng)的異二聚化Fab樣部分。這種產(chǎn)生TriFabs，雙價，雙特異性融合蛋白包含三個功能性Fab單元（圖2-9）.TriFabs包含兩個調(diào)節(jié)性Fabs,作為異源二聚化模塊，通過20個柔性的氨基酸多肽連接子(G4S)4融合而成，產(chǎn)生非對稱的Fab樣抗體。隨后的VH融合一個包含一個Knob（T366W）突變的CH3和一個VL結(jié)構(gòu)域融合一個含有Hole(T366S, L368A,Y407V)的CH3,通過Knob與Hole完成配對。為了增加穩(wěn)定性，在可變區(qū)的主干區(qū)域通過域間二硫鍵起到穩(wěn)定作用(H44-L100)。整個結(jié)構(gòu)類似于IgG,只是Fc被主干區(qū)域替代。在TriFabs中缺少二硫鍵，進(jìn)一步可以通過在CH3結(jié)構(gòu)域(S354C-Y349C)引入二硫鍵得到補(bǔ)償。不同的雙特異性TriFabs表現(xiàn)出不同的功能，例如在莖干區(qū)針對地高辛或生物素，F(xiàn)ab臂針對CD33,GPC3或LeY.的雙特異性抗體。

Fab-Fab融合蛋白可以通過將第一Fab臂的Fd鏈與第二Fab臂的Fd鏈的n端融合產(chǎn)生，產(chǎn)生一個由VHA-CH1-linker-VHB-CH組成多肽鏈，單獨表達(dá)兩條輕鏈（圖2-5）.然而，兩條輕鏈可以隨機(jī)的與Fd鏈，產(chǎn)生四種不同的分子，只有一種是雙特異分子。為了使同源的輕鏈與相應(yīng)的Fd正確組合配對，可以引入一些突變。這其中的一個例子是，利用正交的Fab,已經(jīng)產(chǎn)生了雙特異性Fab-Fab融合蛋白，該蛋白靶向于EGFR和CD3,重定向效應(yīng)T細(xì)胞到表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞。有趣的是，與串連連接的scFv相比，F(xiàn)ab-Fab融合蛋白增加了熱穩(wěn)定性。串聯(lián)的scFv更具有殺傷腫瘤細(xì)胞的潛力，很有可能是分子量相對較小的scFv影響著效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的距離，以及免疫細(xì)胞形成的免疫突觸。

Fab也可以作為異源二聚化的模塊結(jié)合第二個特異性的VH和VL結(jié)構(gòu)域。這一般用于產(chǎn)生Fab-Fv融合結(jié)構(gòu)，一般將VH融合在Fd鏈的C端，將VL融合在輕鏈的C端（圖2-5）。為了穩(wěn)定融合的Fv結(jié)構(gòu)，在鏈間引入二硫鍵（H44-L100）產(chǎn)生Fab-dsFv分子。這些結(jié)構(gòu)增加了Fab的半衰期，直接靶向相應(yīng)的抗原，F(xiàn)v部分可以結(jié)合血清蛋白。Fab-dsFv分子具有在生理條件下穩(wěn)定，保留了針對兩種抗原的親和力，在小鼠和食蟹猴體內(nèi)試驗中，展示了良好的藥物代謝動力學(xué)特征，其效果類似于PEG化的Fab’.

其它缺乏Fc的融合蛋白

缺乏Fc的抗原結(jié)合蛋白scFv的異源二聚化需要借助二聚化的多肽（圖2-6）.異源二聚化多肽多種多樣，包括包含螺旋-螺旋的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，來自于Jun和Fos蛋白中的二聚體“拉鏈”肽融合到Fab’分子或scFv分子中，通過jun,Fos同源二聚體還原、重組、再氧化等方法形成異源二聚體。在另一種方法中，兩種不同的scFv通過雙螺旋模體連接，組裝形成四螺旋束，最終產(chǎn)生四價的雙特異性分子。

IgG的CH1和CL結(jié)構(gòu)域也可以用作形成異源二聚體，雙特異性scFv融合蛋白（圖2-4）。靶向EGFR和CD2的scFv分子通過IgG1的CH1和Cκ結(jié)構(gòu)域形成scFv-CH1/scFv-CL融合蛋白異源二聚化分子。CH1和CL結(jié)構(gòu)域通過自然的二硫鍵共價連接，形成穩(wěn)定的異源二聚體。選擇不同長度，柔性連接子將scFv的N端與CH1或CL相連。CH1-CL異源二聚化模塊進(jìn)一步產(chǎn)生雙特異性單結(jié)構(gòu)域抗體融合蛋白（圖2-4），該結(jié)構(gòu)已成功用于重定向與NK細(xì)胞的CD16抗體和靶向癌胚抗原CEA抗體的雙特異性抗體的構(gòu)建。以鉸鏈區(qū)序列進(jìn)一步延長CH1，形成scFv-CH1-hinge/scFv-CL異源二聚化蛋白，產(chǎn)生四價的雙特異性分子（圖2-17）。這一結(jié)構(gòu)用于靶向HIV gp41抗體和重定向中性粒細(xì)胞IgA受體（CD89）抗體的雙特異性抗體構(gòu)建。雙價的scFv-CH1/scFv-CL融合蛋白和四價的scFv-CH1-hinge/scFv-CL融合蛋白，觀察到明顯的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的病毒抑制作用，但是串聯(lián)的scFv可以靶向同樣的抗原，但是未觀察到病毒抑制活性。

到目前為止，我們描述的是將抗原結(jié)合蛋白直接融合或運用免疫球蛋白衍生物產(chǎn)生異源二聚化結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體。然而，非免疫球蛋白樣的異源二聚體模塊也可以通過不同的結(jié)合位點，以共價或非共價的形式形成異源二聚體。其中一個例子是稱作dock-and-lock的方法（DNL）,該方法利用cAMP依賴的蛋白激酶（PKA）的調(diào)節(jié)亞基與A蛋白酶錨定蛋白的錨定結(jié)構(gòu)域（AD）之間形成異源二聚體完成組裝的策略。在這里，錨定結(jié)構(gòu)域AD由23個氨基酸組成可以跟第一個結(jié)合位點融合，由一個長44個氨基酸的二聚化的DOCK結(jié)構(gòu)域（DDD）融合第二個結(jié)合亞基。這一策略將形成三聚體復(fù)合物，即一個與AD融合的蛋白，兩個DDD融合蛋白結(jié)合形成三聚體，還可以在AD與DDD之間引入二硫鍵，使他們之間通過共價鍵相連。這一設(shè)計產(chǎn)生雙特異性，三特異性抗體的可行性已經(jīng)得到了論證。三價DNL-Fab3融合蛋白可以直接靶向癌拍抗原CEA和組胺琥珀酰甘氨酸（HSG）。兩種融合蛋白（DDD通過14個氨基酸連接在抗CEA抗體Fab的CH1 C端，另一個結(jié)構(gòu)是將AD結(jié)構(gòu)域融合在抗HSP抗體Fab的CH1 C端），將這兩種蛋白單獨表達(dá)，然后結(jié)合在一起，產(chǎn)生兩個位點結(jié)合CEA，和一個位點結(jié)合于HSG的雙特異性抗體，可應(yīng)用于靶向前藥的放射性治療。DNL方法可進(jìn)一步產(chǎn)生Fab2-scFv分子（圖2-6），將scFv融合在AD結(jié)構(gòu)域，可適用于多種特異性抗體包括CD19,CD20,CD22,HLA-Dr,MUC5AC,Trop-2,和IGF-1R結(jié)合抗CD3抗體重定向T細(xì)胞，顯示出該方法的靈活性。另外DNL可以用于產(chǎn)生六價體，雙特異性IgG-Fab4融合蛋白。

其他可能用于產(chǎn)生雙特異性抗體的非免疫球蛋白異二聚模塊的例子包括barnase-barstar系統(tǒng)，適配子/錨定標(biāo)簽?zāi)K（基于突變的RNase I片段），SNARE模塊基于與三種蛋白突觸融合蛋白，小突觸泡蛋白，SNAP25的相互作用，進(jìn)一步產(chǎn)生二元系統(tǒng)。

白蛋白是血漿蛋白，缺少抗體樣效應(yīng)功能，但是具有與IgG分子類似的可結(jié)合FcRn再循環(huán)產(chǎn)生的半衰期。兩個scFv和雙特異性抗體分子融合白蛋白結(jié)合產(chǎn)生雙特異性融合白蛋白樣，具有白蛋白樣特征（圖2-6）。因此將兩個不同的scFv與人血清蛋白(HSA)融合，一個連接在N端，一個連接在C端，充分的延長了scFvs的半衰期。類似的，將串聯(lián)的雙特異性scFv或者scDb,與白蛋白融合，產(chǎn)生相似的功能（圖2-6）。利用該方法產(chǎn)生scFv-HSA-scFv融合蛋白，將靶向HER2和HER3的scFv ,融合進(jìn)修飾的HAS(C34S, N503Q),產(chǎn)生均質(zhì)性很好的融合蛋白，以短的多肽連接子AAS,AAAL分別連接在HAS的N端和C端。當(dāng)然，其他多種蛋白可以融合產(chǎn)生雙特異融合蛋白，例如一些毒素，細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子，結(jié)合雙特異性抗體產(chǎn)生雙靶向具有效應(yīng)功能的融合蛋白。

其他抗原結(jié)合位點移植到scFv

最簡單的雙特異性抗體由抗原結(jié)合位點scFv構(gòu)成，將其修改為包含第二個結(jié)合位點，作為scFv的組成部分。因為免疫球蛋白折疊需要β-片層連接而成，嘗試將互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)嫁接到scFv的底部，以生成雙特異性分子(χsFv)。盡管這一方法沒有進(jìn)一步用作雙特異性抗體的開發(fā)，相關(guān)的方法將抗原結(jié)合位點嫁接在CH3的底部，這一原理也可以用于其它結(jié)構(gòu)域，例如將抗原結(jié)合位點嫁接在CH1-CL的底部形成Fab。

圖3.不同輕重鏈鏈的組合形式以及輕重鏈錯配解決策略

表1.Fc異源二聚化設(shè)計

IgG樣非對稱雙特異性結(jié)構(gòu)

所有雙特異性IgG分子，雙特異性抗體有別于自然的免疫球蛋白，擁有雙價和非對稱結(jié)構(gòu)，至少含有不同的Fv區(qū)域。重鏈和輕鏈的準(zhǔn)備與起源的不同，它們還可能在重鏈或輕鏈的恒定區(qū)域有所不同。

非對稱樣IgG包含來自兩個不同抗體的重鏈和輕鏈

融合兩個雜交瘤細(xì)胞系，產(chǎn)生雜交-雜交瘤(quadroma),該細(xì)胞產(chǎn)生兩種不同抗體重鏈和輕鏈的結(jié)合。產(chǎn)生的雙特異性抗體由第一抗體的重鏈和輕鏈與第二抗體的重鏈和輕鏈構(gòu)成（圖2-2）。兩個抗體重鏈，輕鏈可以是相同的亞型，類型，也可以是不同的亞型，類型。兩個抗體也可以源自不同的種屬，該方法產(chǎn)生三功能性抗體。小鼠源雜交瘤與大鼠雜交瘤融合產(chǎn)生雙特異性，非對稱結(jié)構(gòu)的雜交IgG分子（圖2-2）。描述了重鏈與輕鏈的擇優(yōu)配對。重要的是，異質(zhì)性的Fc部分，可以通過proteinA親和層析分離純化，雜交IgG分子可以在PH5.8的條件下進(jìn)行洗脫。

進(jìn)一步的，表達(dá)不同重鏈和輕鏈的細(xì)胞系可以通過基因工程的手段實現(xiàn)。基因工程手段允許不同的重鏈和輕鏈可以采用不同的人抗體類型組成，甚至允許引入一些突變。如同后續(xù)討論部分所述，允許在重鏈和輕鏈中引入突變以便異源重鏈之間正確的組裝以及促進(jìn)同源重鏈和輕鏈完成正確組裝，同時特定的基因工程改造還可以促進(jìn)正確組裝的雙特異性抗體的純化。

IgG樣非對稱雙特異性抗體借助Fc解決重鏈配對問題

在下面的章節(jié)重點介紹基因工程手段解決重鏈異源二聚化的問題。異源二聚化的重鏈仍舊可以結(jié)合不同的輕鏈，產(chǎn)生四種類型的抗體，但只有一種雙特異性分子，一種非功能性分子，兩個單克隆抗體。運用重鏈異源二聚化的方法將四條多肽鏈隨機(jī)組合形成的10中分子降低到了4種（如圖3）。重鏈的配對借助于最后一個保守結(jié)構(gòu)域。天然IgG分子中CH3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)兩條重鏈的配對，二者之間親和力達(dá)KD~10 pM，借助兩條重鏈的CH3，兩條相同的重鏈形成同源二聚體。進(jìn)一步的相互作用發(fā)生在鉸鏈區(qū)，兩條重鏈之間通過二硫鍵共價連接，這也是我們后續(xù)要提到重鏈異源二聚體組裝所借助的最主要的作用力。在IgG1重鏈形成同源二聚體中，兩條重鏈CH3界面相互作用涉及16個氨基酸殘基，核心氨基酸殘基包括T366, L368, F405, Y407, 和K409，對同源二聚體的穩(wěn)定起著舉足輕重的作用。

過去的20年里，發(fā)展出了各種各樣的策略包括空間的，靜電轉(zhuǎn)向，或者各種設(shè)計的組合，以及形成鏈間二硫鍵，總之，最終是為了產(chǎn)生互補(bǔ)的界面以克服同源二聚體的形成。

受Crick等人在關(guān)于兩條α螺旋氨基酸包裝過程中提出的Knob-into-hole技術(shù)的啟發(fā)，Ridgway和他的同事將這一技術(shù)引入相互作用的CH3界面，在一條重鏈的CH3引入小分子量的氨基酸產(chǎn)生一個Hole，在對側(cè)的CH3作用界面引入較大的氨基酸產(chǎn)生一個Knob,通過嘗試不同的突變，最終確定了適宜形成異源二聚體的突變，在一個CH3做T366Y突變，在另一條CH3做Y407T突變。這一Knob-into-hole突變最先用于抗HER2抗體與抗IGF-1R抗體形成的IgG樣雙特異性抗體上。Knob-into-hole策略進(jìn)一步通過噬菌體展示技術(shù)得到了改進(jìn)和完善，這些突變很快就被用于產(chǎn)生IgG樣雙特異性抗體（圖2-7），并且還嘗試了引入額外的二硫鍵加強(qiáng)Knob-into-hole技術(shù)產(chǎn)生的異源二聚體的穩(wěn)定性。其中一個優(yōu)秀的突變?yōu)樵谝粭lCH3做S354C, T366W突變，在另一條CH3做Y349C, T366S, L368A, Y407V突變（表1）。這一異源二聚體形成策略隨后就用到抗Mlp和抗HER3雙特異性抗體的構(gòu)建中。由于兩個抗體含有相同的輕鏈，因此可以表達(dá)共同輕鏈，異源二聚體產(chǎn)生了功能性雙特異性抗體，可以通過proteinA純化，同時抗體具有Fc介導(dǎo)的ADCC作用。

Knob-into-hole技術(shù)很快得到了廣泛的應(yīng)用，現(xiàn)已成為通用的雙特異性抗體產(chǎn)生策略，而且借此衍生出了更多的理論和結(jié)構(gòu)，包括三價IgG樣抗體，雙特異性Fc，及雙特異性CH3融合蛋白。應(yīng)用的另一個例子是T細(xì)胞重定向雙特異性抗體，為了避免由于雙價CD3抗體系統(tǒng)性的激活T細(xì)胞，借助雙特異性抗體，用單價的CD3抗體與T細(xì)胞結(jié)合。這包括用scFv-Fc（KIH）,即在每個Fc的N端連接著一個scFv。tandem-scFv-Fc(KIH) (BiTE-KIH)即將串聯(lián)的scFv連接在一條Fc上（圖2-9）。在該研究中，CD3抗體部分可以融合在含有Knob的Fc上（KIH）,也可以融合在含有Hole的Fc上（KIH r ）,有趣的是BiTE-KIH r 在表達(dá)滴度上勝過BiTE-KIH，然而在靶向T細(xì)胞激活，以及腫瘤細(xì)胞裂解上沒有區(qū)別。類似的一個方法，利用Fc-KIH產(chǎn)生雙價雙特異性scFv-Fc融合蛋白，該蛋白靶向CD16和HER2,用于招募NK細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞周圍。

單價結(jié)合在一些抗體結(jié)合細(xì)胞表面受體是必要的，例如c-MET,為了避免由受體偶聯(lián)引起的激活。雙特異性抗體以單價的形式結(jié)合與細(xì)胞表面受體，主要應(yīng)用于雙靶向結(jié)合中和不同的受體，一般通過融合Fab臂到含有Hole的Fc N端，在同一條Fc的C端融合上二硫鍵穩(wěn)定化的scFv，共表達(dá)一條含有Knob的非融合Fc鏈（圖2-9）。

將VH結(jié)構(gòu)域融合在Fc(kih)的C端，將VL結(jié)構(gòu)域單獨表達(dá)或者融合在Fc(kih)另一條Fc的C端產(chǎn)生雙特異性，三價IgG-Fv (mAb-Fv)融合蛋白，F(xiàn)v可以借助鏈間二硫鍵穩(wěn)定（圖2-8）。將Fv融合進(jìn)IgG形成IgG-Fv,該融合過程中還可以引入蛋白酶酶切位點，例如在Fv中的VL融合進(jìn)Fc過程中引入furin 或 MMP酶切位點（圖2-8）。經(jīng)過酶切，產(chǎn)生Fc端僅含有VH結(jié)構(gòu)域連接于IgG的雙特異性抗體。類似的，產(chǎn)生了一個scFv-Fc-Fv融合蛋白，含有兩個EGFR結(jié)合位點（scFv融合進(jìn)Fc的N 端），一個LPS抗體的VH結(jié)構(gòu)域融合進(jìn)含有Knob的Fc C端，VL結(jié)構(gòu)域融合進(jìn)含有Hole的Fc C端（圖2-9）。進(jìn)一步借助KIH技術(shù)衍生的雙特異技術(shù)包括TriMAbs。在該技術(shù)中，一個或者兩個二硫鍵穩(wěn)定化的scFv融合進(jìn)Fc(KIH)中的一條或兩條鏈，形成三特異性，三價或四價抗體（圖2-8）.已有TriMAbs抗體靶向EGFR,IGF-1R和/或 cMET和HER3。在該方法中Fab為單鏈Fab構(gòu)成，伴隨二硫鍵穩(wěn)定化的Fv結(jié)構(gòu)域形成scFab-Fc(kih)-scFv2，scFab-Fc(kih)-scFv。

最近，knob-into-hole技術(shù)拓展到IgG其它亞型，產(chǎn)生IgG4異源二聚體，該抗體缺乏Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，例如產(chǎn)生針對IL-14和IL-13的雙特異性抗體。運用基于結(jié)構(gòu)和序列的策略，開發(fā)出CH3界面的多種配對策略，一種突變產(chǎn)生CH3二聚化，該突變稱作HA-TF突變(S364H, F405A /Y349T, 394F)。利用該突變將mAb-Fv (IgG-Fv, mAb-Fv)形式的異源雙特異性分子形成率提高到了~83%。利用該方法開發(fā)出了雙價針對HER2,單價針對CD3的異源二聚化三價雙特異性抗體。進(jìn)一步的利用CH3異源二聚化模塊包括單價和雙價scFv-Fc融合蛋白。

另一種基于結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計是包括一系列的突變，據(jù)報道這些突變體使異源二聚化Fc有很高的熱穩(wěn)定性，而且未檢測到同源二聚體的形成。Fc(ZW1)突變設(shè)計包括T350V, L351Y, F405A, 和Y407V 的第一鏈突變，包含T350V, T366L, K392L, 和 T394W的第二鏈突變，產(chǎn)生雙特異性的IgG, 包含共同輕鏈（圖2-7，表1）。ZW1策略主要依賴與疏水作用力，另一種異源二聚體的形成策略是利用靜電轉(zhuǎn)向的策略來避免CH3結(jié)構(gòu)域的同源二聚化，經(jīng)過突變產(chǎn)生一條帶正電荷的CH3和一條帶負(fù)電荷的CH3,通過靜電引力形成二聚體。在野生型的CH3中發(fā)現(xiàn)了兩條鏈中K409和D399之間的電荷作用。于是將一條鏈的CH3 K409突變?yōu)镈,另一條鏈CH3 D399被突變?yōu)镵,該K409D/D399K突變非常適宜形成CH3異源二聚體。在一條鏈CH3中引入K392D,另一條鏈中引入E356K突變將產(chǎn)生專一性的異源二聚體，運用以上兩種突變結(jié)合，產(chǎn)生K409D, K392D / D399K, E356K突變更利于形成異源二聚體，該策略已經(jīng)用于針對CD3和TARTK scFv-Fc形式的雙特異性融合蛋白的構(gòu)建（圖2-9），最近，該方法也用于產(chǎn)生針對EGFR和HER2或針對硬骨素和DKK-1 IgG樣雙特異性抗體的構(gòu)建。這包括在Fab臂內(nèi)引入電荷配對提高了輕鏈的正確配對。

靜電轉(zhuǎn)向作用也用于Biclonics，該雙特異性抗體用了共同輕鏈技術(shù)和異源二聚化重鏈策略。在該雙特異性抗體中，在一條鏈CH3中（366,366+351）被帶正電的賴氨酸K來替代，在第二鏈的CH3(349,351,355,368)被帶負(fù)電荷的谷氨酸E或帶負(fù)電荷的天冬氨酸D來替代（表1）。利用該技術(shù)產(chǎn)生的針對HER2,HER3的雙特異性抗體MCLA-128已進(jìn)入臨床1/2期。

優(yōu)越的重鏈異源二聚化策略也包括在IgG1和IgG2鉸鏈區(qū)引入帶電氨基酸（圖2-7）。例如IgG1,將第一鏈的鉸鏈區(qū)采用D221E, P228E替代，在第二鏈鉸鏈區(qū)采用D221R 和P228替代（表1）。對于IgG2,第一鏈的鉸鏈區(qū)采用C223E,P228E替代，第二鏈采用C223R,E225R,P228R替代（表1）。在這里，由于E225R可以與第一鏈的E225有靜電引力，所以在IgG2第一鉸鏈區(qū)僅需要突變兩個點。結(jié)合L368E和 K409R，形成在第一鏈C223E,P228E,L368E,第二鏈C223R,E225R,P228R,K409R突變，產(chǎn)生異源二聚體的組裝。運用該方法產(chǎn)生了針對EGFRxHER2的IgG樣非對稱結(jié)構(gòu)雙特異性抗體，也產(chǎn)生了針對CD3Xcd20的IgG樣雙特異性抗體，運用單獨表達(dá)雙特異性抗體中的半抗體，最終由半抗體組裝成完整的雙特異性抗體。

另一項研究，突變向著有利于兩條鏈之間形成疏水作用力的方向進(jìn)行。將兩條鏈中疏水作用核心氨基酸L351, T366, L368, Y407向著疏水作用更大或更小的氨基酸，取代對稱的靜電引力，形成非對稱的疏水作用力，第二，取代那些弱電作用的氨基酸，以長鏈帶電氨基酸形成長距離的靜電作用。其結(jié)果最終形成了第一鏈CH3K360E, K409W突變，第二鏈CH3Q347R, D399V, F405T突變，即CH3 (EW-RVT)形式（表1）。以此策略形成了針對VEGFR-2和MET的scFv-Fc異源二聚化雙特異性抗體，具有很好的生物學(xué)功能（圖2-9）。向以上的突變中引入二硫鍵（第一鏈引入Y349C,第二鏈引入S354C）將增加該異源二聚體的形成，并相應(yīng)增加了其熱穩(wěn)定性。另外，通過酵母展示系統(tǒng)篩選Fc結(jié)合庫，不同的Fc突變經(jīng)過篩選，將異源二聚體的形成率提高到了80%-90%。

基于觀察到的IgG4抗體天然的Fab臂交換動態(tài)發(fā)生在兩條單獨的重鏈組裝成完整IgG4的過程中。Fab臂的交換主要歸因于核心鉸鏈區(qū)序列與CH3區(qū)域內(nèi)的殘基結(jié)合。這一天然發(fā)生的IgG4 Fab交換引入IgG1,通過控制Fab交換形成穩(wěn)定的IgG1雙特異性分子(cFAE)。通過篩選CH3結(jié)構(gòu)域的突變控制Fab交換，在第一抗體中引入K409R突變，在第二抗體中引入F405L突變，這些突變允許兩種單獨表達(dá)抗體混合后，在存在β-met(β-巰基乙醇)還原性環(huán)境的條件下發(fā)生Fab鏈交換，形成雙特異性抗體。利用該方法產(chǎn)生的抗EGFRxCD20雙特異性IgG(DuoBody)(圖2-7)，產(chǎn)生＞95%的雙特異性分子。

CH3界面的互補(bǔ)性允許異源二聚化Fc的組裝可以通過鏈交換工程化結(jié)構(gòu)域（SEED）形成異源二聚體（表1）。鏈交換工程化CH3結(jié)構(gòu)域可以選擇來自人IgA的CH3與IgG 的CH3交換（AG SEED CH3 和GA SEED CH3），產(chǎn)生SEEDbodies。由于該分子模型研究發(fā)現(xiàn)AG SEED CH3降低了與FcRn的相互作用，通過改變CH2-CH3連接的氨基酸殘基將恢復(fù)IgG與FcRn的相互作用。藥代動力學(xué)研究表明SEEDbodies的半衰期與IgG1類似。SEEDbodies的實例包括雙特異性的Fab-scFv-Fc和scFv-Fc融合蛋白靶向EGFR的兩個抗原表位的雙特異性抗體（圖2-9）。該雙表位抗體具有兩種單抗類似的結(jié)合力，但生物活性增強(qiáng)了。

另外跟CH3異源二聚化類似的結(jié)構(gòu)有自然T細(xì)胞受體中α，β亞基形成異源二聚體。該技術(shù)可以用做基于TCR的雙特異性抗體構(gòu)造(BEAT)（表1），可以應(yīng)用于產(chǎn)生Fab/scFv-Fc融合蛋白，而且，可以同時解決了輕鏈錯配的問題（圖2-9）。該方法已用于產(chǎn)生針對HER2和CD3的雙特異性抗體，起到重定向T細(xì)胞的作用。

Leaver-Fay和他的同事應(yīng)用多級設(shè)計（MSD）,該方法設(shè)計多種蛋白層級，同時產(chǎn)生一組CH3突變。兩組突變實例(7.8.60 and 20.8.34)（表1）廣泛用于產(chǎn)生雙特異性抗體，運用該法產(chǎn)生的IgG樣雙特異性抗體由pertuzumab (anti-HER2),matuzumab (anti-EGFR), BHA10 (anti-LTbR),和 MetMAb(anti-cMet)衍生而來。結(jié)合orthogonal Fab相互作用界面的突變，產(chǎn)生高達(dá)93%雙特異性抗體分子。

重鏈的異二聚化組裝也可以通過使用一個單獨的異二聚模塊來實現(xiàn)，該模塊隨后從雙特異性抗體中移除。該方法應(yīng)用于產(chǎn)生亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的異二聚化，基本操作是在兩條重鏈的C端分別融合Acid.p1 (Ap1) 和 Base.p1 (Bp1)多肽。該LUZ-Y平臺產(chǎn)生單價的Fab-Fc融合蛋白，也可以產(chǎn)生含有共同輕鏈的雙特異性IgG抗體，或者產(chǎn)生scFab,該scFab針對EGFR和HER3(圖2-7)。在Fc的C端引入蛋白酶酶切位點和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，通過蛋白酶水解可以切除臉氨酸拉鏈，產(chǎn)生自然狀態(tài)的雙特異性IgG抗體。

圖4.IgG樣雙特異性抗體產(chǎn)生策略

組裝后純化的方式產(chǎn)生雙特異性抗體

以上描述的策略都是基于修飾產(chǎn)生異源重鏈配對完成重鏈的組裝，其他一些突變引入Fc區(qū)將有利于純化異源二聚化抗體。后組裝水平類似于Triomabs策略（如圖4）.Fc引入的突變有利于ProteinA親和層析純化。例如源自IgG3相應(yīng)氨基酸位點的替代，H435R,Y436F,將IgG1Fc的一條鏈做H435R,Y436F替換產(chǎn)生Fc*，該突變廢除了與ProteinA的結(jié)合（如圖2-7），因此，產(chǎn)生的Fc*- Fc*同源二聚體不能與proteinA親和層析柱結(jié)合，而含有異源的Fc Fc*雙特異性抗體與proteinA親和力減弱。然而ProteinA也可以結(jié)合源于VH3家族基因的VH結(jié)構(gòu)域，這將會干擾FcFc與Fc Fc*二聚體的分離。這一問題可以通過proteinA衍生物Z-domain得到解決，這一結(jié)構(gòu)不能與可變區(qū)結(jié)合，可以將異源二聚體從同源二聚體中分離。

另一種使用后組裝純化策略的方法是使用共同重鏈，不同的輕鏈，在這一形式的分子中給定的重鏈可變區(qū)VH結(jié)合不同的輕鏈可變區(qū)VL形成對不同抗原的特異性。因此非對稱結(jié)構(gòu)僅存在Fab臂。該策略用于k/λ bodies，該方法需要表達(dá)三條多肽鏈，一條重鏈，兩條輕鏈（1條κ輕鏈，1條λ輕鏈）（如圖2-2）。含有共同重鏈VH的結(jié)合位點可以通過共有VH域文庫進(jìn)行篩選，也可以篩選含有相同重鏈VH的兩個抗體，或者已有抗體的VH,隨后結(jié)合不同的輕鏈篩選特異性結(jié)合抗原的抗體。需要注意的是一條輕鏈需要為Vκ另一條為Vλ。這一策略已用于多種人類抗原雙特異抗體的構(gòu)建，意味著這一技術(shù)可以推廣使用。共同重鏈和共同輕鏈共表達(dá)與同一細(xì)胞，隨后的雙特異性抗體需要三步色譜純化（1）第一步用IgG-ch1捕獲選擇柱或ProteinA親和層析，2）κ鏈選擇柱，3）λFab親和層析。這一方法無需對重鏈和輕鏈進(jìn)行基因改造，產(chǎn)生天然的雙特異性抗體。然而，產(chǎn)率相對于突變產(chǎn)生的異源二聚體抗體產(chǎn)生的錯配分子多的多，其錯配率高達(dá)50%。

利用基因工程的方法解決非對稱抗體中輕鏈錯配問題

利用修飾迫使重鏈異源二聚化，解決了重鏈錯配的問題，這些策略也可以用于輕鏈解決輕鏈的問題。因此，采用兩種不同的輕鏈將產(chǎn)生四種不同的結(jié)合，只有一種分子是雙特異性分子。很多方法都已開發(fā)出來，結(jié)合Fc修飾（總結(jié)如表1），用于解決同源重鏈，輕鏈正確配對的問題（總結(jié)如表2）。

第一種用于解決輕鏈問題的方法是共同輕鏈。這一方法的基礎(chǔ)在與觀察到通過噬菌體文庫篩選針對不同抗原的抗體時，經(jīng)常會出現(xiàn)輕鏈相同的現(xiàn)象，這反應(yīng)了輕鏈的噬菌體庫非常有限。結(jié)合重鏈的knob-into-hole技術(shù)，產(chǎn)生了針對HER3和Mpl的IgG樣雙特異性抗體。各種各樣的含有共同輕鏈的IgG樣雙特異性抗體相繼出現(xiàn)，比如以knob-into-hole為基礎(chǔ)的修飾，以及其他的Fc修飾方法用于輕鏈。

雖然還未用于產(chǎn)生雙特異性抗體，但這也是共同輕鏈可選擇的一種策略。Surrobodies基于Fab,運用替代的輕鏈，該替代輕鏈由λ5結(jié)構(gòu)域融合VpreB結(jié)構(gòu)域而成。結(jié)合文庫以surrobody形式篩選針對各種抗原的抗體，例如利用該方法差生的雙靶向DR4,DR5的抑制性抗體，因此，該方法也可以用于產(chǎn)生雙特異性抗體。

之前描述的一些Fc修飾運用scFv融合Fc的方法產(chǎn)生雙特異性抗體來規(guī)避輕鏈的問題?；贔ab可以通過單鏈衍生物的形式表達(dá)（scFab在輕鏈的C端與重鏈的N端相連，在一條單鏈上表達(dá)Fab）的發(fā)現(xiàn)，全長IgG分子可以通過輕鏈連接重鏈形式的單鏈來表達(dá)，連接子用30-38個氨基酸(G4 S )6，刪除CH1與CL連接的二硫鍵位點。一個改進(jìn)的scFab平臺包含60個柔性氨基酸的連接子，包含二硫鍵穩(wěn)定scFab。(G4 S )6連接子，結(jié)合Fc的knob-into-hole突變可用于產(chǎn)生Fab-Fc融合蛋白，該結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步修飾，通過C端融合scFv,形成三特異性，三價和四價分子（圖2-7,2-9），該方法實例有針對EGFR,IGF-1R,cMet或HER3抗體，利用一個Fab,和一個串聯(lián)的scFab臂，針對不同位點的兩個scFab（圖2-8）。scFab也可以結(jié)合LUZ-Y Fc異源二聚化策略（圖2-7）。另外，蛋白酶酶切位點引入Fab連接，這就意味著通過酶切水解可以將連接子從正確組裝的IgG雙特異抗體上切除連接。另外單鏈scFab可以結(jié)合未修飾的Fabs產(chǎn)生雙特異性Fab-scFab-Fc融合蛋白，結(jié)合Fc(KIH),形成OAscFab-IgG形式。以該形式產(chǎn)生的針對EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，而且該雙特異性抗體有很高的表達(dá)量。

表2. Fab臂異源二聚化

另一種解決輕鏈問題的方法是利用基因工程的方法改變輕鏈和重鏈相互作用的界面產(chǎn)生正交的相互作用，讓輕鏈以高親和力結(jié)合與通院的重鏈（表2）。該方法主要解決可變區(qū)VH-CL的相互作用，對CH1-CL相互作用進(jìn)行必要的修飾。嘗試各種各樣多層面的突變設(shè)計進(jìn)行比較鑒定。有一組突變適合于正交的Fab。這些修飾用于產(chǎn)生多種IgG樣雙特異性分子例如針對EGFRxcMET,EGFRxHER2,Axl xcMET,EGFR xLTβR,以及利用兩種HER2抗體trastuzumab和pertuzumab抗原結(jié)合位點形成針對兩個HER2不同表位的雙特異性抗體。還有一些實例中Fc的異源二聚化通過靜電作用轉(zhuǎn)向?qū)崿F(xiàn)。例如一個雙特異性抗體中正交的Fab用了pertuzumab (anti-HER2) 和 matuzumab(anti-EGFR),兩個抗體的輕鏈類型都是λ型，pertuzumab抗體重鏈進(jìn)行了Q39K, R62E, H172A, F174G取代，輕鏈進(jìn)行了D1R, Q38R, L135Y, S176W取代(VRD1CRD2修飾)?，結(jié)合matuzumab 抗體重鏈Q(jìng)39Y和輕鏈Q(jìng)38R的取代(VRD2修飾）產(chǎn)生了高達(dá)90%輕鏈正確組裝。

進(jìn)一步的直接作用于輕鏈與同源重鏈Fd配對的策略涉及對Fab臂中重鏈恒定區(qū)CH1和輕鏈恒定區(qū)CL的替換，分別用TCR的Cα,Cβ結(jié)構(gòu)域替換。這已經(jīng)用于產(chǎn)生Fab-IgG樣分子，F(xiàn)ab臂融合在重鏈的N端，以(G4 S )5?連接子連接，也可以產(chǎn)生IgG-Fab分子，F(xiàn)ab臂融合在重鏈的C端，以(G4 S )4 連接子鏈接，例如由trastuzumab和pertuzumab 產(chǎn)生的雙特異性抗體（圖2-1）。然而由于trastuzumab?抗原結(jié)合位點VH/VL強(qiáng)烈的相互作用，僅有少量Fab正確配對，這一現(xiàn)象在VL引入Y36F突變，弱化了VH-VL的相互作用得到了改善，另外，通過在VL和VH引入靜電相互作用VL Q38D, VH Q39K也能達(dá)到弱化VH-VL相互作用的目的（表2）。

CH1-CL配對突變，進(jìn)一步豐富了三價Fab-IgG 融合蛋白的內(nèi)容?；?D結(jié)構(gòu)模型與能量角度的考慮，對兩種突變進(jìn)行了測試。方法一(CR3)，配對相互作用的極性氨基酸突變?yōu)橹行院望}橋形成氨基酸，重鏈CH1 發(fā)生T192E突變，輕鏈CL發(fā)生N137K突變，作為補(bǔ)充，在輕鏈?用丙氨酸取代S114以避免與較大的賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生空間沖突。第二種方法基于疏水性-極性互換(MUT4)，重鏈和輕鏈都發(fā)生兩個點突變，重鏈CH1做L143Q 和S188V突變，輕鏈做V133T 和S176V突變（如表2）。體外測試中方法一（CR3）突變顯示了超級活性，主要歸因于雙特異性抗體更好的穩(wěn)定性，最高的功能活性。

在DuetMab方法中，F(xiàn)ab臂正確配對，主要通過替換CH1-CL天然的二硫鍵，形成新的替換二硫鍵。比較了眾多的突變，鑒定出重鏈CH1 F126C突變結(jié)合輕鏈S121C,產(chǎn)生高達(dá)98%的雙特異性分子（表2）。結(jié)合Fc的knob-into-hole技術(shù)將產(chǎn)生各種各樣的IgG樣雙特異性抗體。例如針對EGFR和HER2,或者針對CD4和CD70的雙特異性抗體，該結(jié)構(gòu)產(chǎn)生高純度，高活性的雙特異性抗體分子（圖2-7）。

半抗體生產(chǎn)后組裝解決輕鏈問題

以上提到的通過基因工程的手段解決不同重鏈和輕鏈正確組裝的問題，所有的組裝都發(fā)生在同一個細(xì)胞中。然而，也有可能將構(gòu)成雙特異性抗體的兩個半抗體分子（一條重鏈和一條同源的輕鏈）單獨表達(dá)后再進(jìn)行組裝形成雙特異性分子（如圖3，4）。這樣，在重鏈Fc引入突變修飾就足以向著有利于形成異源二聚體的方向發(fā)展，或者通過ProteinA或proteinG 親和層析后在進(jìn)行組裝，完全有利于形成異源二聚體。這一概念已經(jīng)在Fc含有knob-into-hole,不含鉸鏈區(qū)的IgG樣雙特異性抗體模型上得到論證。兩個半抗體分別在E. coli中表達(dá)，隨后通過proteinA及其他色譜純化，然后將兩條半抗體復(fù)性產(chǎn)生雙特異性IgG分子。

該方法進(jìn)一步的改進(jìn)措施是將兩個表達(dá)半抗體的E. coli共培養(yǎng)。通過裂解菌體，兩個半抗體釋放，組裝成完整的雙特異性抗體，該方法已經(jīng)在抗EGFR和抗MET抗體形成IgG樣雙特異性抗體中得到驗證。產(chǎn)生相應(yīng)抗體的兩種E. coli克隆需要調(diào)整到最佳比例。因此，經(jīng)過嘗試anti-MET:anti-EGFR 的比例以60:40最為理想。最后通過ProteinA親和層析，疏水作用力層析純化去除半抗體。共培養(yǎng)方法很重要的一點是祛除了氧化還原步驟。該方法已經(jīng)用于抗IL13xIL4,或抗HER2xCD3的雙特異性抗體中。這種中和抗體無需ADCC作用以及其他Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能。

表達(dá)后組裝策略可進(jìn)一步用于鉸鏈區(qū)，以及CH3結(jié)構(gòu)域（IgG1 (EEE - RRR) 和IgG2 (EEE -RRRR) 含電荷配對的突變體組裝成雙特異性抗體的過程中（表1，圖2-7）。兩種抗體可以單獨的在HEK293細(xì)胞中表達(dá)，并通過proteinA親和層析純化，然后將純化抗體置于溫和的還原環(huán)境中產(chǎn)生半抗體，隨后將兩種半抗體等摩爾混合，在溫和的還原條件下，37℃孵育過夜。

用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)可以產(chǎn)生糖基化修飾且未改變Fc效應(yīng)功能的抗體，該方法也適用于產(chǎn)生Knob-into-hole IgG樣雙特異性抗體。

非對稱性Fc及CH3融合蛋白

以上提到的Fc修飾可以用于產(chǎn)生雙特異性Fc或CH3融合蛋白，已經(jīng)有多種實例報道。各種不同的結(jié)合模塊，scFv,Fab,scFab單元等，都已經(jīng)用于雙特異性抗體構(gòu)建。在每條Fc上融合兩種針對不同靶點的scFv，產(chǎn)生雙價的雙特異性scFv-Fc融合蛋白，擁有IgG的特征。該策略還可使用前面提到的Knob-into-hole Fc區(qū)，CH3結(jié)構(gòu)域電荷配對的異源二聚化Fc,以及EW-RVT修飾的Fc（圖2-9）。

另外，一個Fab可以結(jié)合一個scFv,例如每個異源二聚化的Fc的N端融合一個scFv，產(chǎn)生一個Fab-scFv-Fc 融合蛋白（圖2-9）。該方法已經(jīng)用于BEAT Fc修飾。這種方法的一個變體是用CH3結(jié)構(gòu)域形成異源二聚體，例如形成雙特異性的scFv CH3融合蛋白（圖2-9），例如利用該方法產(chǎn)生的一個雙價雙特異性融合蛋白minibody,該融合蛋白將一個anti-HER2 scFv融合在一條CH3結(jié)構(gòu)域的N端，將一個anti-CD16 scFv融合在另一條CH3的N端，在兩條CH3的C端引入二硫鍵，進(jìn)一步穩(wěn)定CH3二聚化結(jié)構(gòu)（圖2-9）。

進(jìn)一步的異源二聚化的Fc區(qū)域可以用來將兩個結(jié)合位點融合進(jìn)一條Fc，另一條Fc不做融合，然后將兩條Fc共表達(dá)（圖2-15）。例如一個雙特異性Fab-Fc-scFv融合蛋白，將anti-Met Fab融合進(jìn)含有hole突變的Fc N端，將anti-digoxigenin二硫鍵穩(wěn)定化的scFv融合進(jìn)含有hole突變的Fc C端,與另一條未融合含有knob的Fc共表達(dá)，形成異源二聚體。在一項研究中，雙特異性串聯(lián)的scFv融合在Fc的N端，產(chǎn)生雙特異性，雙價融合蛋白。在另一項研究中，產(chǎn)生了一個DART-Fc融合蛋白，將DART分子的一條鏈融合進(jìn)帶有knob突變的Fc N端，然后將其與帶有hole的未融合Fc 以及DART的另一條鏈共表達(dá)。還有一種方法是利用knob-into-hole二聚化的Fc,將DART一條鏈融合進(jìn)帶有knob突變的Fc ，然后將另一條DART鏈融合進(jìn)其與帶有hole的Fc，兩條鏈靠DART的二硫鍵共價連接替代鉸鏈區(qū)的連接。該DART-Fc融合蛋白正在開發(fā)用于T細(xì)胞重定向的CD3雙特異性融合蛋白的開發(fā)。為了避免Fc引起的功能效應(yīng)，引入了效應(yīng)缺陷的Fc。這些用于形成雙特異性，雙價抗體特性的方法可以結(jié)合一些延長半衰期的策略一起使用。

對稱結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體

IgGS附加體：scFv融合蛋白

融合額外的結(jié)合位點到重鏈或者輕鏈?zhǔn)亲钪苯咏鉀Q重鏈和輕鏈隨機(jī)配對問題的辦法。這需要將額外的結(jié)合位點以一條多肽連的形式表達(dá)。而且這條多肽連不允許與主體抗體的重鏈和輕鏈發(fā)生相互作用。scFv最適宜做融合搭檔，,而不是單域抗體和支架蛋白。這一基于IgG的附加體擁有對稱的結(jié)構(gòu)和四個價位與抗原結(jié)合，針對每個抗原含有兩個結(jié)合價位，可以通過四條多肽連完成表達(dá)（圖1）。

該方法首次報到是1997年，Coloma 和Morrison1將anti-dansyl scFv?融合進(jìn)anti-dextran的重鏈CH3的C端，或者鉸鏈區(qū)的C端。一個短小的連接子G 3 S?連接在重鏈C端和scFv 的VH結(jié)構(gòu)域的N端。共表達(dá)anti-dextran的輕鏈，產(chǎn)生一個IgG-HC-scFv (CH3-scFv) 或F(ab’)2-scFv2(Hinge-scFv)融合蛋白，該結(jié)構(gòu)包含四個結(jié)合位點（圖2-10，16）。該雙特異性融合蛋白IgG-scFv的分子量達(dá)到200KDa,?F(ab’)2-scFv2分子量為150KDa。該雙特異性抗體結(jié)合兩個抗原，偶爾會碰到scFv親和力的降低。

該方法的進(jìn)一步衍生是在抗體的重鏈（圖2-1）或輕鏈（圖2-11）的N端融合一個scFv，產(chǎn)生scFv-HC-IgG, scFv-LC-IgG，或者在重鏈和輕鏈的N端都融合一個scFv,產(chǎn)生scFv-HC/LC-IgG（圖2-12）。在Fv區(qū)引入二硫鍵會改善分子穩(wěn)定向，減少聚集。該融合蛋白維持高水平表達(dá)，熱穩(wěn)定性，耐蛋白酶切。他們同時保留了Fc的效應(yīng)功能和類似于IgG的半衰期。融合一個scFv到IgG輕鏈的C端也可以產(chǎn)生功能性雙特異性抗體IgG-LC-scFv，許多這樣的抗體保持穩(wěn)定性并且具有與正常IgG相同的特性。在某些抗體中，重鏈和輕鏈之間分布著二硫鍵。因此，IgG重鏈和輕鏈的末端都可用于產(chǎn)生附加體，雙特異性分子。進(jìn)一步研究顯示，在重鏈或輕鏈的N端或者C端融合串聯(lián)的scFv可以產(chǎn)生三特異性抗體。進(jìn)一步的想象包括構(gòu)建多價分子，包括三，多特異性抗體，可以在抗體的重鏈和輕鏈融合相同或不同的scFv分子，盡管有可能會影響結(jié)合點對抗原的結(jié)合，但經(jīng)過優(yōu)化和篩選，可以達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。

在重鏈的CH1融合一個scFv,在輕鏈的CL一端融合另一個scFv可以產(chǎn)生一個四價體，四特異性抗體scFv4-Ig，在恒定區(qū)的兩端含有四個scFv分子（圖2-12），這種方法起初用于產(chǎn)生雙特異性靶向VEGF兩個不同抗原表位的雙特異性抗體構(gòu)建，后來也用于雙靶向于腫瘤細(xì)胞的anti-EGFR x anti-IGF1-R 雙特異性抗體構(gòu)建。

同樣的形式也可以用于EGFR特異性scFv結(jié)合anti-CD3 scFv雙特異性抗體構(gòu)建，重定向T細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞。比較該結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體與等價的scDb-Fc融合蛋白，表現(xiàn)出最高的細(xì)胞毒性。然而由于其200KDa的高分子量，重組蛋白的產(chǎn)量很低，因此scDb-Fc融合蛋白綜合來講，更有優(yōu)勢。

IgG scFv需要考慮的一個關(guān)鍵問題是連接scFv到IgG的連接子。連接子必須穩(wěn)定且具有理想的柔韌性，并且不能與scFv以及抗原IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用。將scFv融合進(jìn)IgG輕鏈或重鏈的C端不能影響IgG與抗原的結(jié)合。然而，在一些連接在N末端的scFv會封閉掉IgG與抗原的結(jié)合位點。?典型的IgG-scFv融合蛋白連接子是2-3個重復(fù)的G 4 S.?。其它一些連接子包括一些親水性的螺旋連接子，例如SNS(EEAKK)3SNS已經(jīng)用于將scFv融合在重鏈C端的連接中。短連接子可能有能力維持抗原結(jié)合，最近三個殘基的連接子GSS已經(jīng)成功應(yīng)用于靶向HER2 X HER3?IgG-HC-scFv構(gòu)建中。

進(jìn)一步的，scFv天然的穩(wěn)定性可能受工藝的影響。因此為了優(yōu)化scFv的穩(wěn)定性，使用更長的連接子（20個氨基酸殘基）連接VH和VL結(jié)構(gòu)域，并且篩選適宜的位點引入二硫鍵以加強(qiáng)二者的相互作用。結(jié)合長連接子，并在VH44和VL100之間引入二硫鍵，穩(wěn)定scFv。在anti-LTbR scFv實例中，使用該策略提高了其熱穩(wěn)定性13℃，運用該策略產(chǎn)生的anti-TRAILR2 x anti-LTbR IgG-scFv 雙特異性抗體以及scFv-IgG融合蛋白都具有理想的藥用開發(fā)價值。

二硫鍵也可以用于改善雙特異性IgG-scFv和IgG-HC-cFv的穩(wěn)定性。為了提高anti-digoxigenin-specific scFv的穩(wěn)定性，在VH Cys44與VL Cys100之間形成二硫鍵。將其融合在不同的特異性抗體，包括HER2,IG1-R, CD22, 和LeY的重鏈C端或者鉸鏈區(qū)。以上的構(gòu)造中scFv由兩個重復(fù)的G 4 S?連接子連接在重鏈的C端，所有的抗體保持了親和力和特異性。所有的雙特異性抗體穩(wěn)定性都很好，未見蛋白聚集。這一策略隨后用到其它抗體，包括cMet, HER1, HER2, 或 HER3。連接子長度的影響，也在HIV受體CCR5兩個不同位點的表位雙特異性抗體IgG-scFv融合蛋白中得到研究。3-6個重復(fù)的G 4 S?連接子在非二硫鍵穩(wěn)定的scFvs中也打得到了研究。用長達(dá)30個氨基酸殘基的連接子鏈接scFv，其穩(wěn)定性跟母本抗體類似，但是在引入二硫鍵穩(wěn)定的scFv中使用了15個氨基酸長度的連接子。

借助噬菌體文庫篩選更穩(wěn)定的scFv可以部分解決scFv穩(wěn)定問題的局限性，早期關(guān)于這方面的研究見于anti-IL17A x anti-IL23雙特異性IgG-scFv融合蛋白的研究中。最后抗體的篩選基于對scFv兩種連接方式VH-VL 和 VL-VH的檢測，SEC-MALS檢測組分穩(wěn)定性，掃描量熱法評估單體的熱穩(wěn)定性綜合篩選各項性能最優(yōu)的分子。類似的，穩(wěn)定性優(yōu)化的scFv已經(jīng)用于產(chǎn)生靶向IGF-1R不同表位的雙特異性抗體構(gòu)建，將scFv融合在IgG的N端或C端。

IgG scFv融合蛋白可以發(fā)揮Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，包括吞噬,ADCC，補(bǔ)體固定，該效應(yīng)功能依賴于不同的抗體亞型和結(jié)構(gòu)形式。例如，在一些應(yīng)用中雙靶向和中和細(xì)胞受體的抗體不會摧毀靶細(xì)胞，這個時候攜帶缺陷型Fc的IgGs更具優(yōu)勢。因此，一個完整的無效應(yīng)功能的Fc區(qū)域，可以通過去糖基化的IgG4.P/IgG1恒定區(qū)嵌合體來替代，這一結(jié)構(gòu)已經(jīng)用于構(gòu)建IgG-HC-scFv樣融合蛋白，將穩(wěn)定性優(yōu)化的抗IGF-1R的scFv融合在anti-EGFR IgG上。其它關(guān)于無效應(yīng)功能的Fc包括一些Fc的突變，或者由IgG2和IgG4衍生而來的嵌合體。

在過去的幾年里，各種不同的雙特異性IgG-scFv融合蛋白已經(jīng)構(gòu)建用于腫瘤治療，在雙靶向，抗體藥物穿越血腦屏障遞送，前靶向放射性免疫治療領(lǐng)域都有應(yīng)用。

IgGs附加體：融合抗體結(jié)構(gòu)域和支架蛋白

作為一種scFv的選擇，單域抗體已經(jīng)用于產(chǎn)生生特異性IgGs附加體分子。例如，抗PDGFRa的單可變區(qū)結(jié)構(gòu)域通過5個氨基酸(ASTKG)的連接子連接在anti-VEGFR-2 IgG輕鏈的N端，保持了兩種抗體的抗原結(jié)合活性和中和作用（圖2-11），該方法隨后拓展，在重鏈的C端融合了一個單結(jié)構(gòu)域（圖2-10）。

隨著各種各樣的支架蛋白開發(fā)為抗體的替代物，于是有了更加多樣的機(jī)會，將支架蛋白融合在IgG的重鏈或輕鏈，產(chǎn)生雙特異性IgG附加體分子。一個實例是Fynomers，分子量只有7KDa的球蛋白，該蛋白源自人Fyn激酶SH3結(jié)構(gòu)域，該蛋白缺乏二硫鍵，但是非常穩(wěn)定，熔解溫度達(dá)到70℃。將該蛋白融合在抗HER2抗體pertuzumab的重鏈或輕鏈的N端或C端，產(chǎn)生雙特異性分子(FynomAbs)，具有中和HER2介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖的能力。基于這些發(fā)現(xiàn)，另一個FynomAb，COVA322，在抗腫瘤壞死因子TNF藥物Humira上融合抗IL-17A Fynomer,?COVA322目前應(yīng)用于銀霄病臨床試驗?1b/2a期。

附加體雙特異性抗體分子可進(jìn)一步通過IgG融合可與配體結(jié)合的受體結(jié)構(gòu)域來形成。盡管與經(jīng)典的雙特異性抗體不同，該分子仍然展示出兩種不同的特異性。

IgGs附加體:融合Fab臂

在IgG上融合Fab臂，例如串聯(lián)的Fab融合在Fc上用于產(chǎn)生四價的(Fab)2-Fc融合蛋白，于是形成了Fd加長的重鏈，與輕鏈表達(dá)產(chǎn)生Tandemabs。該形式可用于產(chǎn)生四價雙特異性(Fab)2-Fc融合蛋白。在這里產(chǎn)生雙特異性分子也面臨著輕鏈的問題，原因是存在著8種組合的可能，但只有一種是雙特異性分子。

Brunker 和他的同事運用CrossMab技術(shù)產(chǎn)生雙特異性IgG-Fab分子，將第二個Fab以(G 4 S)4?連接在IgG分子上（圖2-7）。在該方法中融合的Fab以VH-CL,VL-CH1的方式連接，該方法已經(jīng)用于產(chǎn)生三價雙特異性抗體，該抗體可靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）,用來靶向活化的腫瘤基質(zhì)纖維母細(xì)胞，另一個抗原結(jié)合位點為DR5(TRAIL receptor 2) ,來通過死亡受體誘導(dǎo)凋亡（圖2-10）。VHCL 和VLCH1 順序上存在著差異。在VLCH1形式中，VL結(jié)構(gòu)域融合在HC的C端，與母本抗體相比，降低了對FAP的結(jié)合，而VHCL（VH融合在HC C端）形式的抗體結(jié)合活性沒有改變。結(jié)合knob-into-holeFc 區(qū)，該方法也可以產(chǎn)生三價，雙特異性IgG-Fab融合蛋白。

orthogonal Fab在上文中已描述到，可用于產(chǎn)生三價，雙特異性Fab-IgG融合蛋白（圖2-10）。在這里，外Fab臂通過Fd與重鏈VH相連，內(nèi)Fab通過(G4 S )5連接，該方法已經(jīng)用于產(chǎn)生雙特異性Fab-IgG?，比如產(chǎn)生抗HER2的Fab-IgG，抗HER2的可來自于pertuzumab 和trastuzumab。Fab-IgG融合蛋白與scFv-IgG融合蛋白相比具有相同的特異性，但是有著更優(yōu)越的生物物理特性和獨特的生物學(xué)活性。

Fab-IgG融合蛋白也可以將帶電荷殘基突變或疏水-極性交換突變引入CH1-CL。在這個研究中第一個抗體的Fd片段融合者一個鉸鏈區(qū)（野生型或擁有兩個半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸），然后通過STPPTPSPSGG連接子連接在CH1含有CR3或MUT4突變的重鏈上。內(nèi)Fab結(jié)合位點的同源輕鏈含有相應(yīng)的突變。因此，分子中重鏈含有野生型鉸鏈區(qū)通過兩個Fd之間附加的鉸鏈區(qū)形成的二硫鍵共價連接（圖2-10）。雙特異性Fab-IgG融合蛋白，功能上呈現(xiàn)三價，外部的Fab臂針對HLA-DR,內(nèi)側(cè)的Fab靶向CD5。良好的穩(wěn)定性，有限的蛋白聚集，體外實驗顯示CD5 x HLA-DR(CR3)分子有很好的生物活性。在內(nèi)部Fab含鉸鏈區(qū)不含半胱氨酸的分子表現(xiàn)出一定程度的結(jié)合力減少，在某些方面，如在補(bǔ)體激活方面，效應(yīng)功能減弱。

如前文描述一樣，含有TCR?Cα 和Cβ結(jié)構(gòu)域的Fabs應(yīng)用于和第二個Fab臂重鏈的N端或C端以(G4S)4相連，如前文所述源于trastuzumab 和 pertuzumab形成的雙特異性抗體。在一條Fab臂中額外的突變引入VL結(jié)構(gòu)域(Y36F)來減弱VH-VL相互作用，結(jié)合VL和VH之間突變引起的電荷相互作用(VL Q38D, VH Q39K)，進(jìn)一步促進(jìn)同源Fab臂的正確配對。

IgGs附加體：融合額外的重鏈和輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域

在IgG的重鏈和輕鏈分別融合第二個特異性的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VH和VL，產(chǎn)生所謂的雙可變區(qū)抗體DVD-Ig(圖2-12)。最初的DVD-Ig用于構(gòu)建靶向IL-12和IL-18的雙特異性抗體，該形式已經(jīng)用于多種抗體的雙特異性抗體構(gòu)建，包括IL-1a和 IL-1b,HIV gp41和 gp120,CD20 和 CD47, EGFR 和 HER3,CD20 和 HLA-DR,以及HER2，CEA,DOTA的兩個不同表位抗體。分析了一系列DVD-Igs ，針對TNF和另一個可替換的治療靶點，兩個結(jié)合位點的位置互換（內(nèi)部，外部互換），用于重鏈和輕鏈上的連接子不同的連接長度，從5-13個氨基酸，對這些影響抗體功能因素逐一的作了研究。結(jié)果顯示，當(dāng)針對TNF的結(jié)合位點位于內(nèi)部時，親和力要低一些，這有可能是空間位阻的原因，導(dǎo)致了結(jié)合速率的降低。當(dāng)兩個可變區(qū)在一條鏈上時，連接子也影響著結(jié)合。在另一個gp41和gp120 特異性DVD-Igs研究中，結(jié)果顯示內(nèi)部結(jié)合位點需要至少15個氨基酸長度的連接子，而且選擇螺旋型連接子，對DVD-Igs比柔性連接子更加有效。利用單粒子電子顯微鏡對DVD-Ig進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其外結(jié)合位點具有高度的流動性，可以折疊出平面外，使抗原與內(nèi)結(jié)合位點結(jié)合，而DVD-Ig結(jié)合IL-12和IL-18 的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)一步證實了這一點。

進(jìn)一步對DVD-Ig技術(shù)的研究是在外部和內(nèi)部VL之間引入蛋白酶酶切位點，例如金屬蛋白酶酶切位點。這些可激活的DVD-Ig可以靶向外部結(jié)合位點，例如細(xì)胞表面，通過酶切，可以結(jié)合另一個抗原。該方法用于針對ICAM 和TNF的 aDVD-Ig增強(qiáng)了對炎癥部位的特異性，減少了脫靶造成的對炎癥組織的損傷。

交叉雙可變區(qū)結(jié)構(gòu)域Ig樣蛋白(CODV-Ig)代表著另一種形式：兩個VH和兩個VL結(jié)構(gòu)域相互連接通過交叉配對形成VH-VL結(jié)構(gòu)域，它們的排列順序可以變化（從N端到C端），以VHA-VHB和VLB-VLA或者以VHB-VHA和VLA-VLB的排列順序排列（圖2-12）。因此，無論是輕鏈，還是重聯(lián)，可變區(qū)順序是可以變化的，而另一條鏈以第一條鏈的順序為模板，因此，總共會產(chǎn)生四種排列結(jié)構(gòu)形式。?由于只在CODV-Igs中生成循環(huán)的自包含結(jié)構(gòu)，所以CODV-Ig格式與DVD-Ig格式不同。?CODV-Ig形式已經(jīng)用于構(gòu)建針對IL-4和IL-13,TNF和IL-12/23雙特異性抗體。連接子(L1 to L4) 擁有不同的長度，包含alL-glycine的連接子，通常用于連接兩個可變區(qū)，以及連接內(nèi)部可變區(qū)到恒定區(qū)第一個結(jié)構(gòu)域。盡管連接子的長度和序列影響著產(chǎn)量和蛋白聚集傾向，研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有經(jīng)過分析的連接子都可以實現(xiàn)Fv和Fc的正確配對。?通過抗IL-4 x抗IL13 CODV-Fab的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了其結(jié)合位點的緊密組裝，并與抗原形成復(fù)合物。

修飾的IgG分子

基于對稱Fc和CH3的雙特異性抗體

自然抗體，F(xiàn)c的主要作用是形成同源二聚化模塊，而且還介導(dǎo)相應(yīng)的效應(yīng)功能，如ADCC,細(xì)胞吞噬，補(bǔ)體固定。運用Fc區(qū)，通常進(jìn)一步包括鉸鏈區(qū)形成二硫鍵共價連接，雙特異性抗體可以通過在抗原結(jié)合部位的N端融合另一半雙特異性模塊，或者在N端和C端融合抗原結(jié)合位點，例如scFv，產(chǎn)生四價雙特異性抗體。

該方法應(yīng)用于針對 TNF和熒光素異硫氰酸酯(FITC)的兩個scFvs的概念驗證研究。第一個scFv (anti-TNF) 融合在含有鉸鏈區(qū)修飾的IgG1的Fc上，第二個scFv (anti-FITC) ，連接在Fc的C端，在第二個scFv的連接過程中，對不同的連接子進(jìn)行了測試，包括(G4S)3AAA 連接子, A4T連接子 (T(A4T)3AAA), 和一個 CL 連接子 (EGKSSGASGESKVDAAA) （圖2-13）。所有的三個連接子都可以形成雙靶向分子，類似于scFv-Fc-scFv融合蛋白的穩(wěn)定性。A4T 連接子隨后用于產(chǎn)生針對IT1和CXCL13scFv-Fc-scFv 融合蛋白。該蛋白顯示單克隆抗體樣特性，比如產(chǎn)量，穩(wěn)定性以及粘度。該方法進(jìn)一步用于產(chǎn)生針對LPS和EGFR的三價雙特異性抗體，該雙特異性抗體運用了二硫鍵穩(wěn)定化的scFv經(jīng)G4S連接子連接在Fc上。

雙特異性diabody格式用于生成Fc融合蛋白，方法是將其中一條diabody鏈與共價連接的CH3結(jié)構(gòu)域或Fc鏈融合（圖2-13,14）。這將產(chǎn)生所謂的Di-Diabodies，該結(jié)構(gòu)是四價的，雙特異性分子構(gòu)成了兩條鏈，一條VLB-VHA CH3 或 VLB-VHA-Fc 鏈，與第二條鏈VLA-VHB共表達(dá)。該方法已經(jīng)用于產(chǎn)生針對EGFR 和IGF-1R.的Di-Diabody，盡管Di-Diabody在結(jié)合力上顯示了雙受體中和活性，體外試驗顯示，結(jié)合力有所減弱，這可能主要歸因于兩條鏈在循環(huán)中發(fā)生解離。

scDb有著顯著地穩(wěn)定性，這要歸因于雙特異性diabody四個可變區(qū)的共價連接。在Fc上融合一個scDb產(chǎn)生三價的雙特異性分子，在分子量，藥代動力學(xué)性質(zhì)上都和IgG類似。

上文提到的Fcab形式可用于產(chǎn)生scFv-Fcab融合蛋白，由一條鏈編碼（圖2-13）。在Fc的C端有兩個抗原結(jié)合位點，而且Fc的N端融合這兩個scFv形式的額外抗原結(jié)合位點。這一形式已經(jīng)用于產(chǎn)HER2,CD3雙特異性抗體，scFv結(jié)合與CD3,在體外實驗和動物模型上都看到了T細(xì)胞重定向的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。

源于免疫球蛋白衍生物結(jié)構(gòu)域同源二聚化的雙特異性抗體

多種多樣的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形成同源二聚體，例如IgG,IgA,IgD中的CH3,IgM,IgE中的CH4。此外，在IgM,IgE中的CH2起著鉸鏈區(qū)的作用，將Fab臂與CH3,CH4相連。與IgG,IgA,IgD不同的是，IgM,IgE中的CH2通過1-2個二硫鍵共價連接，而且存在額外的N-連接糖基化位點。這些結(jié)構(gòu)域可用于錨定產(chǎn)生四價雙特異性分子（圖2-14，15）例如，在IgM,IgE CH2的N端和C端融合scFv或一個diabody，也可以在CH2 N端融合一個單鏈diabody(scDb-CH3) 。

表3.雙特異性抗體臨床研究進(jìn)展

雙特異性抗體產(chǎn)業(yè)化展望

雙特異性抗體形式如圖2所示，闡述了近100多種不同的形式，是我們目前已知曉的雙抗及其衍生物構(gòu)建形式。本文旨在囊括截止2016年9月，文獻(xiàn)中描述的所有概念上不同的經(jīng)過實驗驗?證的格式，但是不得不承認(rèn)我們忽略了有些結(jié)構(gòu)形式。抗體由不同的結(jié)構(gòu)域組成，這些組成部分中部分模塊互換就可以構(gòu)成不同的形式。因此，將有更多的形式及衍生物創(chuàng)造出來，有一些已經(jīng)被創(chuàng)造了出來。

形式上巨大的多樣性導(dǎo)致了一個問題：我們真的需要這么多的形式嗎，如果是，為什么？這么多可用的結(jié)構(gòu)形式一個很大的原因是這種模塊化構(gòu)造的結(jié)構(gòu)域多樣性強(qiáng)大的組裝潛力。在很多案例中，這些模塊化的結(jié)構(gòu)域就像搭積木一樣，不同的搭建方式產(chǎn)生千變?nèi)f化的結(jié)構(gòu)。因此，因此，抗體工程一直是一個有趣的領(lǐng)域，值得研究人員在生物制藥行業(yè)，以及學(xué)術(shù)和政府機(jī)構(gòu)設(shè)置。經(jīng)過20多年的發(fā)展，只要遵循特定的法則，現(xiàn)在幾乎可以保證成功?？捎玫?或不可用的)自由操作(FTO)或知識產(chǎn)權(quán)(IP)空間、對某些格式的限制以及保護(hù)自身開發(fā)的愿望可能是雙特異性抗體格式爆炸的額外驅(qū)動因素。這些因素和其他因素最初導(dǎo)致了對這種多樣性必要性的一些懷疑。“格式動物園”如今已被相當(dāng)多的設(shè)計師等同于游樂場。我們承認(rèn)，動物園和游樂場對許多年輕、活躍、開放和探索的人類有相似的吸引力，我們不認(rèn)為這是壞事!

與此同時，現(xiàn)實表明，擁有多樣性的形式不僅是設(shè)計師智慧的表現(xiàn)，而是雙特異性抗體療法進(jìn)展必要的和一個關(guān)鍵的驅(qū)動因素。越來越多的基因工程雙特異性抗體目前正處于臨床發(fā)展階段，有些已進(jìn)入晚期有些已經(jīng)可以作為藥物使用(表3)。這些雙特異性抗體表現(xiàn)出非常不同的形式，有些是大的，包含恒定區(qū)域，有些是小的，沒有恒定區(qū)域。事實上，大多數(shù)主要形式的簇都是由一個或多個已進(jìn)入臨床的分子組成的。很明顯，即使沒有FTO或IP限制或競爭/戰(zhàn)略挑戰(zhàn)，“一刀切”不能應(yīng)用于過多的含有期望功能和雙特異性抗體的應(yīng)用。

格式多樣性是雙特異性抗體應(yīng)用所需的

由于需要產(chǎn)生的雙特異性抗體的多樣性和所需特性的可變性，因此不可能有‘一種最佳格式’用于大多數(shù)所需的分子組合。不同的靶點產(chǎn)物索要達(dá)到的預(yù)期療效（對產(chǎn)物功能和行為的界定）需要多種形式的分子構(gòu)造，這包括在分子大小，排列順序，價位，靈活性，幾何學(xué)構(gòu)造等方面都要考慮最終產(chǎn)物與結(jié)合分子的結(jié)合，同時要考慮藥物的最終分布以及藥代動力學(xué)。

為了實現(xiàn)雙特異性，需要考慮的因素包括不同靶抗原的特殊排列或大小，在某些情況下，還要考慮把抗原在細(xì)胞表面的密度。這決定了哪些形式可以同時或相互排斥地實現(xiàn)二價、三價或多價與一個或兩個抗原的結(jié)合。小的格式變化，如鏈接長度或結(jié)構(gòu)的微小變化或域的“切換”，可能是功能的關(guān)鍵決定因素。一些設(shè)計參數(shù)可以從結(jié)構(gòu)模型中推導(dǎo)出來。然而，在許多情況下，必須通過生成和比較不同格式的功能來確定合適的格式。

分布和藥代動力學(xué)行為是直接受雙特異性抗體格式選擇影響的其他重要參數(shù)。在需要較長的半衰期時，分子結(jié)構(gòu)設(shè)計需要＞50KDa 以避免被腎臟清除，以及其它方面的設(shè)計確?？贵w可以通過FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)。FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)是包含F(xiàn)c雙特異性抗體的基本特征（確保FcRn結(jié)合位點不能有突變）。另一種策略是引入血清白蛋白以增加FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)。小分子量雙特異性抗體用于哪些需要快速起效，快速分布的需要?；蛘呦Ｍ麌?yán)格控制其水平，以選擇快速降低水平。

鑒別具有預(yù)期功能的雙特異性抗體只是藥物開發(fā)的第一步

盡管格式多樣性是雙特異性抗體用于不同功能的先決條件，我們想要強(qiáng)調(diào)的是，在現(xiàn)實生活中，并不是所有的動物園成員都是可以輕易處理的。有些看起來不錯，但實際上表現(xiàn)很差。為了藥物開發(fā)，分子和格式需要以可重復(fù)的方式大量生產(chǎn)，最好是用已建立的或類似的方法以高產(chǎn)量生產(chǎn)。組成結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，經(jīng)常需要對表達(dá)式系統(tǒng)進(jìn)行更廣泛的優(yōu)化。必須特別指出的是表達(dá)體系的穩(wěn)定性和產(chǎn)量并不是唯一需要考慮的因素。事實上，雙特異性抗體的組成和不需要的副產(chǎn)物的存在或不存在具有同等(或更高)的重要性。

除了適用于生產(chǎn)和上下游加工外，雙特異性抗體還需要定義明確、穩(wěn)定和整體“表現(xiàn)良好”才能成為藥物。這些參數(shù)中的許多都是在術(shù)語“可開發(fā)性”下討論的。滿足可開發(fā)性標(biāo)準(zhǔn)的雙特異性抗體將是穩(wěn)定的(例如，針對熱變性)，具有較低的聚集傾向、較低的積累化學(xué)偏差的傾向，并且(取決于應(yīng)用方式)優(yōu)先能夠在高濃度下配制而不存在粘度問題。

因此，設(shè)計、優(yōu)化和表征具有預(yù)期特異性和功能性的雙特異性抗體只是一個漫長過程的開始。將這些分子轉(zhuǎn)化為藥物是一項艱巨的任務(wù)。然而，這部分是關(guān)鍵，沒有這部分，雙特異性抗體就只能是動物園里的外來成員，而不是藥物。