背景介紹

癌癥轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的重要原因之一，以非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）為例，其高死亡率與轉(zhuǎn)移潛力大緊密相關。了解癌癥轉(zhuǎn)移的分子機制有助于改善臨床治療效果，本文中，作者在小鼠模型上驗證了細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）在NSCLC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用。

研究內(nèi)容

FAM3C與肺癌不良預后相關

通過LTQ-FT 質(zhì)譜分析，作者發(fā)現(xiàn)FAM3C蛋白在腫瘤細胞（HCC82、H1650、H520）EVs和成纖維細胞EVs中差異表達，臨床樣本驗證結(jié)果顯示FAM3C高表達與NSCLC不良預后相關。

對數(shù)據(jù)庫中已有的數(shù)據(jù)進行分析，作者發(fā)現(xiàn)FAM3C在惡性肺癌組織中的表達高于正常肺組織，同時FAM3C高表達與較差的預后相關。

44名患者的scRNA-Seq結(jié)果顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移灶FAM3C表達增加。肺腫瘤組織及正常肺組織免疫組化染色并進行觀察，結(jié)果顯示FAM3C主要定位于細胞質(zhì)，且在腫瘤細胞中表達量高。

根據(jù)上述結(jié)果，作者推測FAM3C可能在NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

FAM3C促進肺癌細胞定植

通過在不同肺癌細胞系中對FAM3C進行敲除及過表達，以及FAM3C敲除細胞與FAM3C蛋白共孵育的拯救實驗，作者驗證了FAM3C誘導癌細胞遷移與侵襲的能力。

為驗證體內(nèi)FAM3C的作用，小鼠尾靜脈注射敲除或過表達FAM3C的肺癌細胞，建立小鼠肺定植模型。一段時間后取肺組織進行觀察，結(jié)果顯示FAM3C過表達使癌細胞侵襲性增強，小鼠的整個肺實質(zhì)被破壞。

檢測不同癌細胞及對應腫瘤組織中FAM3C的表達情況，結(jié)果顯示來源過表達FAM3C癌細胞的腫瘤組織中，FAM3C的表達明顯更高。

由以上結(jié)果推知，F(xiàn)AM3C在肺癌轉(zhuǎn)移和發(fā)展過程中發(fā)揮積極作用。

腫瘤來源EVs介導FAM3C的細胞間轉(zhuǎn)移

收集肺癌細胞EVs并檢測FAM3C，結(jié)果顯示FAM3C在肺癌細胞來源的EVs中富集。為研究EVs與FAM3C促進肺癌細胞侵襲的關系，過表達FAM3C的肺癌細胞（FAM3C-overexpressed H2170）以及A549細胞用于EVs分離，分離的EVs進行表征鑒定。隨后，將EVs與親本細胞孵育，觀察是否能被攝取，結(jié)果顯示H2170細胞與熒光標記的EVsFAM3C孵育后，可觀察到熒光信號，證實了其對EVsFAM3C的攝取。此外，可以觀察到攝取EVsFAM3C后，細胞表現(xiàn)出更強的侵襲性。

含F(xiàn)AM3C的腫瘤來源EVs促進癌細胞轉(zhuǎn)移

小鼠尾靜脈注射PBS、EVsControl、EVsFAM3C，一段時間后注射A549 細胞與PBS、EVsControl或EVsFAM3C的混合物，第七周進行觀察。結(jié)果顯示三組均形成腫瘤結(jié)節(jié)，其中EVsControl、EVsFAM3C組出現(xiàn)更多的腫瘤細胞簇。在肺腫瘤結(jié)節(jié)中檢出FAM3C，進一步證明了FAM3C是癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因子。

FAM3C誘導癌癥相關信號通路的激活

RNA-Seq結(jié)果顯示，在過表達FAM3C的細胞（FAM3C_ox A549）中，4210個基因表達上調(diào)，4702個基因表達下調(diào)。對差異表達基因進行分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組擾動與肺癌、乳腺癌等相似，差異表達基因集中在與腫瘤細胞運動性和侵襲性相關的通路。

轉(zhuǎn)錄組分析及熒光定量PCR驗證結(jié)果顯示，過表達FAM3C的細胞中參與JAK-STAT3信號通路和KRAS信號通路的基因上調(diào)，提示FAM3C可能參與信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應。磷酸激酶陣列檢測結(jié)果顯示，ERK1/2、MEK1/2、Akt、Src、Stat3磷酸化水平升高，免疫印跡驗證了這一變化。

由以上結(jié)果，作者推測FAM3C可能通過激活Stat3信號通路發(fā)揮作用。

RalA參與FAM3C對下游信號通路的激活

通過檢索數(shù)據(jù)庫（gpsprot.org），作者發(fā)現(xiàn)FAM3C激活下游信號通路可能需要RalA的參與。

一系列實驗結(jié)果支持了這種假設：免疫印跡結(jié)果顯示過表達FAM3C的細胞系中磷酸化RalA水平升高而沉默F(xiàn)AM3C降低了RalA的磷酸化水平；免疫共沉淀實驗證實了FAM3C和RalA之間存在蛋白-蛋白相互作用；原位鄰位連接技術進一步表明FAM3C與RalA在肺癌細胞中共定位。

后續(xù)實驗中，作者構(gòu)建沉默RalA的A549細胞系，并證實RalA表達量降低抑制了FAM3C的促腫瘤作用，由此推測，RalA抑制劑（BQU57）可能存在抗腫瘤功效。之后的免疫印跡分析表明，BQU57以劑量依賴方式降低了p-RalA和FAM3C的表達，同時抑制了Stat3磷酸化（FAM3C的下游信號分子）。在功能上，BQU57也表現(xiàn)出對腫瘤細胞侵襲性和錨定依賴性生長的抑制作用。

主要結(jié)論

本研究中作者通過一系列實驗證明，在NSCLC中，腫瘤細胞可通過攜帶FAM3C的EVs推動腫瘤轉(zhuǎn)移及遠端定植，這一機制與LIFR的表達水平無關。對這種新的腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究，將有助于制定更精準的腫瘤治療策略。

Thuya WL, Kong LR, Syn NL, Ding LW, Cheow ESH, Wong RTX, Wang T, Goh RMW, Song H, Jayasinghe MK, Le MT, Hu JC, Yong WP, Lee SC, Wong AL, Sethi G, Hung HT, Ho PC, Thiery JP, Sze SK, Guo T, Soo RA, Yang H, Lim YC, Wang L, Goh BC. FAM3C in circulating tumor-derived extracellular vesicles promotes non-small cell lung cancer growth in secondary sites.?Theranostics. 2023 Jan 1;13(2):621-638. DOI: 10.7150/thno.72297. PMID: 36632230; PMCID: PMC9830426.