IF= 29.0丨首次揭示HDCA對NAFLD的治療潛力及機制
非酒精性脂肪肝（NAFLD）以肝脂肪變性為特征，可發(fā)展為肝脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝細胞癌（HCC）。非酒精性脂肪肝還與其他代謝性疾?。ㄈ缫葝u素抵抗 (IR)、2型糖尿病 (T2DM) 和心血管疾病 (CVD)）并存，增加了不良臨床結果的風險。迄今為止，非酒精性脂肪肝還缺乏有效的治療性藥物。
2023年8月16日，上海交通大學賈偉、鄭曉皎及賈偉平以共同通訊作者在《Cell Metabolism》上在線發(fā)表了題為“Hyodeoxycholic acid alleviates non-alcoholic fatty liver disease through modulating the gut-liver axis”的研究論文，發(fā)現了NAFLD 患者的獨特代謝特征，并且發(fā)現口服豬去氧膽酸（HDCA）物質可顯著改善高脂飲食 (HFD) 喂養(yǎng)小鼠的 NAFLD 表型，表明 HDCA 具有治療 NAFLD 的潛力。值得注意的是，在本研究中，作者使用了漢恒生物提供的AAV-shCyp7b1病毒，對Cyp7b1基因進行了敲低。
接下來，讓我們一起來了解一下這篇文章吧。
鑒于膽汁酸（BA）與包括肥胖和糖尿病在內的代謝異常之間存在明確的相關性，作者對由 251 名參與者（178 名 NAFLD 患者和 73 名健康對照者）組成的隊列進行了研究，以闡明血清中 BA 水平，尤其是豬膽酸(HCA) 種類、HDCA和甘氨豬去氧膽酸 [GHDCA] 的總和）與非酒精性脂肪肝之間的關系。結果發(fā)現與對照不同，非酒精性脂肪肝患者血清中 HCA 種類的水平顯著降低，尤其是 HDCA + GHDCA的種類，由此將非酒精性脂肪肝與 HDCA 的耗竭聯系起來了。
臨床和動物實驗數據顯示，NAFLD 受試者血清和肝臟中的 HCA 種類（尤其是 HDCA）水平顯著降低。作者又進一步評估了HDCA和豬膽粉（bilepowder，從豬膽汁中提取的富含HDCA的粉末）對NAFLD小鼠模型的治療效果。結果發(fā)現，豬膽粉和HDCA顯著減少了肝細胞中積累的過量脂滴和肝臟重量。HFD+HDCA或HFD+豬膽粉組血清ALT（丙氨酸氨基轉移酶）水平顯著降低，AST（谷草轉氨酶）水平也有所降低，但無統計學意義。作者又評估了 HDCA 在兩種 NAFLD 小鼠模型中的治療效果，發(fā)現HDCA治療后小鼠肝臟TG、組織學評估（脂肪變性、氣球樣變、炎癥和纖維化評分）和血清ALT均顯著改善，這與db/db小鼠模型的中結果一致。這些結果表明HDCA 緩解了 NAFLD 表型。
圖1. HDCA減弱NAFLD相關代謝表型
為了研究HDCA或豬膽粉對整體表達的影響并確定其潛在的分子靶標，作者利用對照組、HFD組、HFD +豬膽粉組和HFD + HDCA組的肝組織進行RNA測序（RNA-seq）分析。基因分層聚類數據顯示，除HFD組外，對照組、HFD+膽粉組和HFD+HDCA組都聚類在一起。根據KEGG通路富集分析發(fā)現，主要膽汁酸生物合成通路受到嚴重影響。根據基因豐度繪制火山圖，發(fā)現在Cyp7a1下調的同時，Cyp7b1顯著上調，這表明在HDCA干預下，BA的生物合成過程從經典途徑轉向了替代途徑。qPCR 和蛋白質印跡分析也驗證了 RNA-seq 的結果，即 CYP7A1 下調的同時 CYP7B1 表達顯著上調。作者通過腺相關病毒（AAV）在小鼠肝臟對Cyp7b1進行敲低和過表達， HFD喂養(yǎng)20周的小鼠注射AAV，隨后給予HDCA或豬膽粉處理8周，發(fā)現HDCA 或豬膽粉的治療效果在shCyp7b1小鼠中有所下降。當肝臟Cyp7b1被敲低時，干預組中肝臟 TG 和血清 ALT 水平的緩解作用也減弱，而當肝臟Cyp7b1過表達時，肝臟中脂肪的積累大大減少，代謝紊亂也得到很大改善，與HFD+HDCA組相似。這些結果表明CYP7B1驅動的BA替代生物合成在減輕肝臟脂肪變性中發(fā)揮著至關重要的作用，也可能是HDCA抗NAFLD作用的關鍵機制。
圖2. HDCA 激活了以 CYP7B1 為主要目標的 BA 替代合成途徑
緊接著，作者探究并破譯了HDCA改變BA合成途徑的分子機制。在研究中發(fā)現HDCA 或豬膽粉在不同小鼠模型中均抑制腸道FXR-FGF15信號傳導，具體表現在腸道 mRNA、蛋白質表達、血清中 FGF15 的水平以及腸道 FXR-FGF15 信號傳導的水平變化。為了證實HDCA對FXR通路的抑制作用，作者培養(yǎng)了小鼠腸道類器官，并在體外觀察到 FXR 靶基因表達的減少。當使用腸道限制性 FXR 抑制劑甘氨酸-β-木膽酸（Gly-MCA）來模擬HDCA對腸道 FXR 信號轉導的影響時，發(fā)現肝臟 CYP7A1 和 CYP7B1 均上調，這與 HDCA 上調 CYP7B1 和下調 CYP7A1 的效果不同。這一差異表明，還有其他因素導致 BA 合成發(fā)生改變，從經典途徑轉向替代途徑。作者認為HDCA 誘導的腸道微生物群改變可能有助于緩解肝臟脂肪變性，并在小鼠中進行糞便微生物群移植 (FMT)來加以驗證。HFD組和HFD+HDCA組小鼠的糞便經抗生素抑制腸道微生物后分別植入無菌小鼠體內。與 FMT-HFD 組相比，接受 HFD + HDCA 組糞便的小鼠肝臟脂肪積累減少。此外，與接受 HFD 組腸道微生物群的小鼠相比，它們還表現出較低水平的 TC、TG、ALT 和 AST，并且葡萄糖穩(wěn)態(tài)得到改善。FMT-HFD + HDCA組中CYP7A1的表達下調，而CYP7B1的表達上調，與HDCA干預結果一致。使用 FMT 和抗生素的小鼠的這些代謝表型和 BA 合成模式證實了腸道微生物群在 HDCA 對肝臟脂肪變性的治療效果中的關鍵作用。
圖3. HDCA 以腸道依賴的方式減輕肝臟脂肪變性
隨后，為了確定豬膽粉和 HDCA 如何影響重塑的腸道微生物群，作者對HFD、HFD +豬膽粉和HFD + HDCA組的盲腸內容物進行了宏基因組測序。PCoA 分析顯示，HFD 和豬膽粉/HDCA 治療組之間的腸道微生物群落有明顯的聚類，具有統計學上的顯著性，這意味著豬膽粉或HDCA干預后腸道微生物群具有顯著差異。三組中的α多樣性（香農指數）保持不變。在門水平上，經豬膽粉和HDCA處理后，厚壁菌門顯著減少，而擬桿菌門（P. distasonis）顯著增加。作者通過的生長曲線研究 HDCA、CA 和 CDCA 對P. distasonis生長的影響，發(fā)現 HDCA比CA和CDCA更能加速P. distasonis的生長，這表明HDCA為P. distasonis的繁殖提供了有利的環(huán)境。為了測試 HDCA 誘導P. distasonis的重要性，作者又進行了P. distasonis單定植實驗，將HDF誘導小鼠每天用活P. distasonis (HFD + LPD) 或熱滅活的P. distasonis (HFD + KPD) 口服喂養(yǎng)，持續(xù)8周。結果顯示，HFD+LPD組脂肪堆積程度明顯減輕，肝臟CYP7B1表達增加，CYP7A1表達減少。然后，作者探究了受 HDCA 和膽粉影響的微生物組功能，根據 VIP 評分，發(fā)現與 HFD 組相比，其不飽和脂肪酸途徑的生物合成顯著增加，P. distasonis的相對豐度與不飽和脂肪酸生物合成途徑呈正相關，這表明P. distasonis參與了不飽和脂肪酸代謝。為了進一步驗證這一點，作者在HFD組和對照飲食組提取物中培養(yǎng)了P. distasonis ，以確定食品成分是否為腸道微生物群提供了底物。有趣的是，P. distasonis在 HFD 提取物中培養(yǎng)時會在很短的時間內產生 γ-亞麻酸 (C18:3)。
圖4. HDCA富集了distasonis Parabacteroides 及其衍生脂肪酸
分析RNA-seq數據中的轉庫因子，發(fā)現PPAR信號通路顯著上調，并且PPARα在HDCA影響的所有轉錄因子中排名第一。鑒于 PPARα 公認的配體是脂肪酸，作者認為P. distasonis衍生的 γ-亞麻酸誘導了PPARα 調節(jié) BA 合成酶的表達。將原代小鼠肝細胞與 PPARα 激動劑吡尼尼克酸 (Wy-14643) 和不同濃度的 γ-亞麻酸共培養(yǎng)，結果表明 CYP7A1 受到抑制。為了研究 γ-亞麻酸調節(jié) CYP7A1 的機制，作者通過雙熒光素酶實驗檢測了吡尼尼克酸 (Wy-14643) 和 γ-亞麻酸對 CYP7A1 的轉錄活性的影響，發(fā)現 PPARα/RXRα 的過表達降低了 CYP7A1 轉錄活性，添加吡尼酸和 γ-亞麻酸后，活性進一步降低。使用Pparα ?/?小鼠HFD 喂養(yǎng) 12 周后，發(fā)現HDCA 和P. distasonis并沒有顯著改善這些小鼠的脂肪肝表型。在原代肝細胞上使用 FGF19 和 PPARα 激動劑來模擬腸-肝軸對 CYP7A1 的綜合影響，發(fā)現與 PPARα 激動劑和低劑量 FGF19 共培養(yǎng)時，CYP7A1 受到抑制。PPARα 激動劑（Wy-14643 和 pemafibrate）處理原代肝細胞，察到 FXR 表達上調，用 pemafibrate 處理Pparα -/?小鼠的原代肝細胞，觀察到 FXR 表達幾乎沒有變化，并且，單獨使用 HDCA 不能直接上調肝臟 FXR 表達。這些結果表明肝臟 PPARα 可能被 γ-亞麻酸激活，進而激活肝臟 FXR。
圖5. 腸道微生物群產生的脂肪酸介導的 PPARα 激活抑制了 CYP7A1
綜上所述，本研究的結果表明了HDCA 通過抑制腸道 FXR 激活以 CYP7B1 為中心的替代途徑，并通過 P. distasonis -γ-亞麻酸 -PPARα 信號傳導來抑制以 CYP7A1 為中心的經典通路，從而改變肝臟 BA 合成途徑。這一研究發(fā)現或為NALFD藥物研發(fā)提供了新思路。
圖6 HDCA改善肝臟脂肪變性的分子機制
