菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之間熒光強度最高， F/P值過高熒光探針會自我淬滅并影響生物分子的生物活性，標記生物分子最好是用單琥珀酰亞胺酯，但是用雙修飾的CyDye NHS并沒有發(fā)現(xiàn)交聯(lián)。CyDye NHS標記抗體在pH (8。5～9。4)時10分鐘F/P可達5～6，而在pH 7。0幾乎不反應。我們用不同比例的Cy3標記anti-glutathione-S-transferase(GST)多克隆抗體發(fā)現(xiàn)用1:1，5:1，10:1 和 20:1標記時得到的F/P值分別是 0。28:1，1。16:1，2。3:1和4。6:1。

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操作步驟：

一、 水溶性Cy3 NHS ester標記anti-GST多克隆抗體

市場上買到的抗體如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或帶氨基的緩沖液會影響標記，在標記前需純化。

1。?在1 L 0。15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0。5 mL at3 mg/mL)，常溫透析4小時。

2。?在4°C用新鮮的1 L 0。15 MNaCl 溶液再透析過夜。

3。?第二天用1 L 0。1 M NaHCO3 (pH 8。3)透析4小時。

4。?用0。22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5。?用0。1 M NaHCO3 稀釋少量的抗體，在280nm處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量 （IgGantibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1 cm-1 at 280 nm)。

6。?用DMSO配置Cy3 NHS (MW765。95) 溶液濃度為10 mg/mL；計算所需體積以得到想要的CyDye NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

7。?用1 L 0。15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時除去未標記上的Cy3。

8。?在4°C用新鮮的1 L 0。15 MNaCl 溶液再避光透析過夜。

9。?用1 L of 0。01 M PBS/ 0。01% ****溶液常溫避光透析4小時， 在4°C常溫避光再次透析過夜。

10。?用0。22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11。?用0。01 M PBS/0。01 % ****整數(shù)倍稀釋標記抗體溶液，測量280nm（蛋白）和552nm（Cy）處的紫外可見吸光度。

12。?產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0。01 M PBS/ 0。01% ****溶液中，-20℃避光儲存。

F/P計算：

Cy3在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000

M-1cm-1；不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣；Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm處的8%。

按以下公式計算F/P值。

[Cy3] = A552/150000

[antibody] = {A280 - (0。08×A552)}/170000

F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1。13×A552}/{A280 - (0。08×A552)}

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二、 水溶性Cy5 NHS ester標記 (D-ser2)-leucineenkephalin

1。?Cy5 NHS 1。0 mg溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine- enkephalinacetate(YSGFLT，0。75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）

2。?然后加入15 μL，常溫避光攪拌反應混合物過夜。

3。?用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫。從0。1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0。1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（對不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動相）

4。?收集適當?shù)纳珟Х澹瑯擞浂嚯牡谋Ａ魰r間比未標記的多肽長。

5。?產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲存；必要時可用質(zhì)譜表征。

6。?CyDye標記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4 ℃可避光保存2月；更長期的保存需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存。

F/P計算：

Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數(shù)為250 000 M-1cm-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數(shù)為170000M-1cm-1；Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計算F/P值。

[Cy5 dye] = (A650)/250 000

[peptide] =[A280 -(0。05×A650)]/170000

F/P final= [dye]/[peptide]= {0。68×A650}/{A280 - (0。05×A650)}

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三、 水溶性Sulfo Cy3 NHS ester 標記OLIGO

氨基封端的OLIGO可以標記CyDye SE，但是非常困難；標記前因為OILGO經(jīng)水脫保護，請務必洗滌掉所有的殘余。然后將樣品真空干燥；然后溶于0。25ml 的0。5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50脫鹽，用5。0 mM borate 緩沖液平衡到pH=8。0，然后用緩沖液沖下OLIGO。

然后濃縮至干的樣品溶于0。1M carbonate buffer (pH 8。5-9。0)；在0。5mL碳酸緩沖液中30nmoles的OLIGO加入到CyDye SE的玻璃瓶中室溫避光，密閉攪拌反應60min。反應物經(jīng)Sephadex G-50或RP-HPLC過柱純化，冷凍干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides和oligopeptides由于太小經(jīng)常會留在過濾膜上或在凍存管內(nèi)貼壁成膜，而無法標記。

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四、 小動物活體成像領(lǐng)域的應用

活體動物體內(nèi)成像技術(shù)是指應用影像學方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進行組織、細胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)。小動物活體成像是近年來在生物醫(yī)藥方面非?；钴S和前沿的領(lǐng)域，在研究細胞行為，藥物活性和代謝，疾病的進展等方向取得了革命性的進步。分為生物發(fā)光成像（以Caliper 和Xengon 儀器為代表）和熒光成像（以KODAK 和CRI 儀器為代表）。

1、熒光成像的推薦步驟：

（1） SPF級 BALB/C裸鼠，6～8 周齡，18～20克，實驗前24 h 自由進食、飲水。

（2） 于實驗前將裸鼠腹腔內(nèi)注射麻醉藥物。將裸鼠俯臥位平放于小動物多光譜活體成像系統(tǒng)的記錄暗箱中。實驗時將Cy7或Cy7標記的生物分子或藥物最好溶于水（或甲醇/乙醇/乙二醇，有時DMSO 200uL能把小鼠殺死）稀釋后，于裸鼠尾靜脈注射200μL（濃度0。5 mg/mL），最佳用量和時間需要客戶根據(jù)自己的儀器和藥物試劑等條件優(yōu)化。每5min記錄1 張動物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光藥物的分布情況。對照鼠不注射藥物，進行同時記錄。記錄結(jié)束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進行成像。

（3） Cy7 檢測時激發(fā)波長700～770 nm 帶通，發(fā)射波長790 nm 長通。液晶可調(diào)諧濾光片掃描范圍 780～950 nm，掃描步進10 nm。曝光時間為500 ms。不同的藥物代謝時間不一樣，注射入裸鼠體內(nèi)，熒光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈現(xiàn)顯著的腎排泄的特點一般4～6 小時，快的只有30 分鐘；如果是骨骼和鼻腔等部位靶點的Cy7 標記藥物，有客戶反映一周后活體成像系統(tǒng)仍能檢測到熒光成像。器官切片觀察：將解剖的器官迅速放置固定4 小時以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚賴氨酸洗過的載玻片貼片，晾干，DAPI 染色。共聚焦顯微鏡觀察，激光器為氦氖 633 nm。

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2、熒光成像常見問題

（1） 什么類型的小鼠適合活體成像？

毛發(fā)對光有散射，建議用裸鼠。

（2） 給裸鼠注射的最佳和最大注射試劑體積？

試劑的體積用量根據(jù)所采取的方式不同而不同，下面是體重25g 的裸鼠注射量。

?（3） 注射針頭的尺寸是多少？

推薦使用具有固定針頭的28～32 號結(jié)核菌素或胰島素注射器（0。3 或1mL）

（4） 腫瘤成像需要注射多大劑量的標記抗體？

推薦起始用量50μg 來優(yōu)化最佳用量。

（5） 未標記的染料在老鼠體內(nèi)如何代謝？

未標記水溶性染料通過膀胱排泄，靜脈注射后最快能在3min 檢測到膀胱內(nèi)的熒光信號。

（6） 注射后多長時間開始成像？

成像時間和成像持續(xù)時間與注射試劑有關(guān)。血管示蹤劑注射后馬上即可成像并持續(xù)成像數(shù)小

時。注射標記的抗體IgG 到達靶點需要數(shù)小時，而后才成像并持續(xù)成像數(shù)天。

（7） Solar Fluor dyes 的熒光壽命是多少？

Solar Fluor 647 在20°C 水中τ＝1 ns

Solar Fluor 680 在20°C 水中τ＝1。2 ns

Solar Fluor 750 在20°C 水中τ＝0。7 ns

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穩(wěn)定性與儲存：

未開封的粉末在避光干燥-20℃存放12月。CyDye NHS水溶液現(xiàn)配現(xiàn)用不能儲存。任何溶解后的CyDye NHS粉末最好立即使用；絕對無水的DMSO溶液-20°C保存最多2個星期。