寫在前面

????????今天推薦的是由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院及上海腫瘤研究所等團隊在2018年12月7日發(fā)表于Oncogene（IF：7.744）的一篇文章，通訊作者是Yongzhong Liu教授，研究表明抑制去泛素酶USP1使KPNA2不穩(wěn)定并抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。

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研究背景

????????乳腺癌是全世界女性最常見的癌癥，發(fā)生轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，而新興證據(jù)表明，復(fù)雜的轉(zhuǎn)移過程與蛋白質(zhì)修飾的失調(diào)有關(guān)。泛素化是一種可逆的翻譯后修飾，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性和定位。去泛素酶（DUBs）負責(zé)從底物蛋白上去除泛素鏈或泛素分子以控制修飾。DUBs功能異常引起的泛素化不受抑制與包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生和發(fā)展有因果關(guān)系，乳腺癌轉(zhuǎn)移便與這種異常的泛素化調(diào)控有關(guān)。由于DUBs在乳腺癌發(fā)病機制中的重要作用，基于其臨床潛力，有必要對DUBs的藥理靶向性進行更多的研究。

摘要部分

????????泛素特異性肽酶1（USP1）屬于DUBs的USP家族，與其他USP蛋白類似，USP1含有高度保守的Cys和His結(jié)構(gòu)域，其中Cys90位點對于DUB的活性至關(guān)重要。目前，人們關(guān)于USP1在乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移擴散中的作用還知之甚少。本研究證明了去泛素酶USP1的過度激活有助于乳腺癌的轉(zhuǎn)移。原發(fā)性乳腺癌標本中USP1表達上調(diào)與乳腺癌患者轉(zhuǎn)移性進展和不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，USP1可增強乳腺癌細胞中多個促轉(zhuǎn)移基因的表達，同時促進細胞在體外的遷移和侵襲以及乳腺癌細胞的肺轉(zhuǎn)移。?
????????另外，作者還確定了KPNA2為具有促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力的USP1的去泛素化底物。更重要的是，特定的抑制劑Pimozide或ML323對USP1功能的藥理學(xué)干預(yù)可顯著抑制小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移，這提示了使用USP1抑制劑治療乳腺癌患者的基本原理。因此，作者的研究揭示了USP1可作為治療乳腺癌的新靶點，并提供證據(jù)表明使用抑制劑干擾USP1可能是抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在方式。

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研究內(nèi)容

1.促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的去泛素酶USP1的鑒定

????????為了鑒定調(diào)控乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的去泛素化酶（DUBs），作者最初利用transwell遷移測定法篩選出了一組DUBs，它們在乳腺癌組織中表達水平相對較高。作者用針對每種DUBs的三種非重疊siRNA混合物轉(zhuǎn)染了細胞，結(jié)果顯示USP1的沉默顯著降低了MCF7細胞的遷移能力。進一步的實驗表明USP1的下調(diào)可顯著抑制細胞的遷移和侵襲能力，但對細胞增殖無明顯影響。與這些結(jié)果一致，過表達UPS1可極大增強細胞的遷移和侵襲能力。? ? ?
????????接下來，作者探究了USP1在人乳腺癌細胞中的促轉(zhuǎn)移活性在高轉(zhuǎn)移性小鼠4T1細胞中是否保守。結(jié)果顯示，USP1缺失也可顯著抑制4T1細胞的遷移和侵襲，而USP1過表達產(chǎn)生了相反的作用。為進一步證實USP1在乳腺癌中的功能，作者探究了USP1是否促進乳腺癌的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，攜帶USP1缺失的4T1細胞的小鼠肺部表面轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)比對照組小鼠少，而USP1的過表達顯著加重了小鼠肺組織中4T1細胞的轉(zhuǎn)移損傷。有趣的是，USP1的過度表達或缺失并沒有明顯改變原發(fā)性4T1腫瘤的生長。

研究結(jié)論：USP1是一種在乳腺癌細胞中具有促轉(zhuǎn)移活性的去泛素酶，但不影響細胞增殖。

2.USP1表達與人類乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)? ? ? ?

????????為進一步探討USP1表達與人類乳腺癌的臨床相關(guān)性，作者首先通過免疫組化染色分析比較了兩組人類乳腺癌組織微陣列（TMA）中USP1的蛋白水平。作者發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，USP1在腫瘤組織中的表達上調(diào)，而且與原發(fā)性腫瘤細胞相比，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的癌細胞中甚至存在更高水平的USP1。通過分析公開數(shù)據(jù)集中患者樣本的USP1水平，作者發(fā)現(xiàn)USP1的高表達與遠處無轉(zhuǎn)移的生存率降低相關(guān)。? ? ?
????????接下來，作者使用數(shù)據(jù)集進行了基因集富集分析（GSEA），結(jié)果顯示高表達USP1的患者腦復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移中表達上調(diào)的基因均顯示富集，這表明與低表達USP1的患者相比，高水平USP1個體的腫瘤組織更傾向于發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。作者使用公共數(shù)據(jù)庫調(diào)查了不同癌癥階段之間USP1的表達模式，觀察到在較高階段中的USP1表達升高。GSEA分析表明，已知III級癌中上調(diào)的基因在高水平USP1的患者中顯著富集。因此，USP1水平高的患者富集了與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)的基因標簽。

?研究結(jié)論：USP1促進人類乳腺癌的轉(zhuǎn)移且與不良預(yù)后相關(guān)，高表達的USP1個體更容易出現(xiàn)預(yù)后不良。

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3.USP1促進人乳腺癌中促轉(zhuǎn)移分子的表達

????????接下來，作者通過RNA測序檢查了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與對照組細胞相比，在用兩個獨立的USP1 siRNA轉(zhuǎn)染的細胞中，一系列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達同時發(fā)生了變化。對表達譜的分析表明，沉默USP1所影響的過程包括粘著斑粘附、癌癥中的蛋白聚糖、ECM-受體相互作用和TGF-β信號傳導(dǎo)。獨創(chuàng)性途徑分析（IPA）顯示了與乳腺癌細胞運動和遷移相關(guān)的基因的USP1依賴性富集。值得注意的是，許多與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，例如S100A4，TIMP1，TIMP2，COL6A2，PGF，F(xiàn)YN，ITGA5，ITGA6，LOXL2，CLDN4和SPARC，都因USP1缺失而呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)。作者用定量實時PCR（qRT-PCR）進一步驗證了幾種差異基因的表達。? ? ? ?
????????為了進一步確定由USP1缺失引起的轉(zhuǎn)錄本差異表達模式是否相應(yīng)地存在于臨床乳腺癌中，作者根據(jù)USP1水平將乳腺癌樣本分為兩組，從而分析了人類乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE15852。結(jié)果表明，參與粘著斑通路和乳腺癌細胞運動的幾種基因的表達都與USP1轉(zhuǎn)錄本水平呈正相關(guān)。

研究結(jié)論：USP1可促進乳腺癌中促轉(zhuǎn)移基因的表達。

4.USP1通過去泛素化作用與KPNA2相互作用并使其穩(wěn)定

????????為了進一步闡明USP1在乳腺癌中促轉(zhuǎn)移的分子機制，作者通過親和純化和質(zhì)譜對USP1的相互作用組（所有與其相互作用的分子）進行了分析。質(zhì)譜分析表明，已報道參與癌癥轉(zhuǎn)移的核蛋白KPNA2是與USP1相互作用的蛋白之一。體外的免疫共沉淀實驗結(jié)果也顯示USP1和KPNA2之間有相互作用。作者又通過在MCF7和MDA-MB-231細胞中使用抗USP1或抗KPNA2抗體進行co-IP檢測，進一步證實了USP1和KPNA2的內(nèi)源性相互作用，另外發(fā)現(xiàn)了過表達USP1和KPNA2的共定位主要在MCF7的細胞核中。? ? ?
????????接下來，作者直接評估了USP1是否可以調(diào)節(jié)乳腺癌細胞中KPNA2的表達。結(jié)果顯示，乳腺癌細胞中USP1缺失顯著抑制了KPNA2的表達，而過表達USP1則顯著增加了KPNA2的表達水平。各類實驗結(jié)果表明，USP1與KPNA2相互作用并促進其在乳腺癌細胞中的表達。

????????由于USP1的缺失并未顯著改變?nèi)橄侔┘毎蠯PNA2的mRNA水平，因此作者進一步探討了KPNA2上調(diào)是否在功能上需要USP1和KPNA2的相互作用。實際上，USP1的過表達顯著提高了用環(huán)己酰亞胺（CHX）處理的細胞中KPNA2蛋白的穩(wěn)定性，而敲低USP1則加速了KPNA2的降解。重要的是，蛋白酶體抑制劑MG132大大抑制了USP1缺失引起的KPNA2的下調(diào)。這些結(jié)果表明，USP1參與了乳腺癌細胞中KPNA2的翻譯后調(diào)控。為了進一步證實這些發(fā)現(xiàn)，作者探究了USP1是否調(diào)節(jié)KPNA2的泛素化。結(jié)果顯示，過表達USP1的細胞中KPNA2蛋白的泛素化程度大大降低。相反，敲低USP1的細胞中KPNA2泛素化水平顯著提高。接下來，作者通過將泛素化的KPNA2與純化的野生型USP1或不具酶活性的突變體C90S蛋白進行共同孵育來進行體外去泛素化檢測。結(jié)果顯示，WT-USP1有效地從KPNA2蛋白中去除了泛素鏈，但C90S突變體并未產(chǎn)生明顯的調(diào)節(jié)作用。

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5.USP1通過調(diào)控KPNA2促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移

????????已知KPNA2可以促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移，并與各種類型癌癥患者的預(yù)后不良有關(guān)。為了評估USP1是否通過調(diào)控KPNA2來促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移進程，作者將靶向KPNA2的siRNA轉(zhuǎn)染到強制表達USP1的MCF7細胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KPNA2的沉默可以徹底抵消USP1介導(dǎo)的腫瘤遷移和入侵增強的效果。此外，KPNA2的過表達顯著增強了對照細胞的遷移和侵襲，也可以使敲低USP1的MCF7的細胞遷移能力恢復(fù)。? ? ?
????????接下來，作者進一步探究了KPNA2是否參與了USP1介導(dǎo)的基因表達調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)在缺失KPNA2的細胞中，USP1調(diào)控的基因（例如PGF，ITGA6，SPARC，COL6A2，CAPN2，BMP6和LOXL2）的mRNA水平也被下調(diào)，而KPNA2的過表達有效地恢復(fù)了這些基因的表達。Snail是一種在癌癥轉(zhuǎn)移中具有重要作用的蛋白質(zhì)，它在USP1或KPNA2基因被敲低的MCF7細胞中的表達水平被相應(yīng)地下調(diào)。這些結(jié)果進一步將KPNA2定位為USP1在調(diào)節(jié)乳腺癌轉(zhuǎn)移中的下游效應(yīng)蛋白。? ? ?
????????為了探究USP1是否在體內(nèi)通過KPNA2的調(diào)控促進乳腺癌轉(zhuǎn)移，作者在USP1過表達的4T1細胞中穩(wěn)定敲低KPNA2，并將它們和對照細胞注射入雌性BALB / c小鼠的乳腺脂肪墊中。結(jié)果顯示，USP1的轉(zhuǎn)移活性至少部分是通過穩(wěn)定KPNA2來介導(dǎo)的，因為相對于對照組，過表達USP1的4T1細胞中KPNA2的缺失顯著削弱了肺結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成。更重要的是，USP1介導(dǎo)的KPNA2表達調(diào)控可以轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。乳腺癌組織芯片免疫組化染色顯示USP1和KPNA2的表達呈正相關(guān)?？傊?，這些結(jié)果強調(diào)了KPNA2在USP1介導(dǎo)的促進乳腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用。

?研究結(jié)論：KPNA2是USP1在調(diào)節(jié)乳腺癌轉(zhuǎn)移中的下游效應(yīng)蛋白，USP1通過調(diào)節(jié)KPNA2促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

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6.用Pimozide或ML323對USP1進行藥物干預(yù)可抑制小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移? ? ?
????????接下來，作者探究了USP1的藥理抑制作用是否可以對小鼠的乳腺癌轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。為此，作者首先使用了USP1抑制劑pimozide，該藥物已在臨床上用于患有抽動穢語綜合征、精神分裂癥和慢性精神病的患者，其最近被證明可抑制USP1的表達和酶促USP1 / UAF1復(fù)合物的活性。結(jié)果顯示，pimozide處理會導(dǎo)致乳腺癌細胞（MCF7，MDA-MB-231和4T1）中KPNA2和USP1的表達呈劑量依賴性降低。? ? ?
???????? 為了探究pimozide是否會影響乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，作者用pimozide處理了這些細胞，并觀察到pimozide顯著抑制了腫瘤的遷移和侵襲能力，并抑制了幾種促轉(zhuǎn)移基因的表達。為了進一步研究pimozide對體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移進程的影響，作者在雌性小鼠的乳腺脂肪墊中注射了4T1細胞，并在注射腫瘤細胞后第9天開始用pimozide對這些小鼠進行治療。正如預(yù)期的那樣，使用pimozide治療可顯著降低4T1原發(fā)性腫瘤中USP1蛋白的水平。在小鼠中，USP1靶標的大多數(shù)促轉(zhuǎn)移基因在pimozide特治療后在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄水平降低。同時，作者發(fā)現(xiàn)全身使用pimozide可顯著減少肺部表面轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)量，但并未影響腫瘤的生長。? ? ?
????????另外，作者還發(fā)現(xiàn)了ML323作為一種高效能的USP1-UAF1的抑制劑，具有顯著抑制乳腺癌細胞的遷移與侵襲的能力。體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)進一步表明，ML323治療也可抑制攜帶4T1腫瘤的小鼠的肺轉(zhuǎn)移。

?研究結(jié)論：USP1抑制劑pimozide和ML323均可降低乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力，且沒有明顯的細胞毒性。

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結(jié)論與討論

????????作者研究表明，USP1在體外和體內(nèi)的乳腺癌轉(zhuǎn)移中均起促進作用，還進一步揭示了USP1是通過介導(dǎo)KPNA2的去泛素化來促進癌細胞轉(zhuǎn)移，值得注意的是，在臨床乳腺癌樣本中USP1和KPNA2的表達協(xié)同上調(diào)，進一步暗示了USP1調(diào)控KPNA2在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的病理意義。另外本研究還證實了USP1抑制劑Pimozide或ML323能有效抑制小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移。因此，未來需要進一步探討靶向USP1在乳腺癌中的治療意義。

Thank you!

????????原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41388-018-0590-8