藥物性肝損傷（DILI）指在藥物使用過程中，因藥物本身或/及其代謝產物或由于特殊體質對藥物的超敏感性或耐受性降低所導致的肝臟損傷，占非病毒性肝病中的20%－50%，是急性肝衰竭（ALF）的最常見原因，而對乙酰氨基酚（APAP）過量是藥物性ALF的主要原因。

Mas是調節(jié)性RAS的效應受體，在組織內廣泛表達，有研究顯示Mas在損傷、炎癥及代謝中占據重要地位，激活Mas具有減輕損傷、抗炎、改善脂代謝紊亂等有益作用。

近日，同濟大學楊長青教授團隊在《Journal of Hepatology》（IF=30.083）發(fā)表文章“Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice（肝細胞特異性Mas激活增強噬脂和脂肪酸氧化以保護小鼠對抗對乙酰氨基酚誘導的肝毒性）”該團隊提出肝細胞Mas基因的激活增強了AKT-FOXO1信號通路調控的脂噬和下游脂肪酸氧化（FAO），可以保護小鼠免受APAP誘導的肝毒性，Mas可能是DILI的一個新的治療靶點。值得一提的是，在該研究中使用了漢恒生物的AAV2/8來抑制Mas基因的表達，以此研究Mas基因在肝內的作用。

首先，作者通過比較人類DILI組和健康組的Mas基因水平，發(fā)現(xiàn)DILI組肝內Mas明顯上調，接著利用APAP刺激人類和小鼠肝細胞，發(fā)現(xiàn)肝細胞中的Mas mRNA同樣顯著上調（圖1），因此，作者得出結論：Mas可能在DILI進程中發(fā)揮重要作用。

圖1. Mas的表達水平

為了證實這一結論，作者敲除肝細胞中的Mas1基因后使用APAP刺激小鼠，通過肝細胞死亡和炎癥浸潤的組織學評估（圖2A）和測定血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平（圖2B），發(fā)現(xiàn)肝損傷顯著加重，當使用致死量的APAP刺激小鼠時，小鼠的存活率明顯降低（圖2C）。

圖2.Mas基因敲除實驗

另外，作者還使用了AVE0991（Mas活化劑）進一步實驗，組織學和生化評估結果表明，預給藥AVE0991對使用過量APAP刺激的小鼠有保護作用（圖3A和B），顯著提高了WT-APAP小鼠的存活率（圖3C）。

圖3. AVE0991對WT-APAP小鼠的保護作用

以上實驗證明Mas在DILI進程中發(fā)揮了重要作用，敲除Mas導致肝損傷加重，而激活Mas則可以減輕肝損傷，那么Mas是如何發(fā)揮作用的呢？作者猜想Mas是通過影響AKT-FOXO1軸進而調節(jié)脂噬和脂肪酸降解最終在肝損傷進程中發(fā)揮作用。

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脂噬是一種特殊類型的自噬，指脂滴被自噬小體吞噬后，自噬小體與溶酶體融合，脂滴內的甘油三酯（TAG）被溶酶體內的酸性脂肪酶水解的過程。水解產生的游離脂肪酸（FFA）通過脂肪酸氧化（FAO），被氧化分解生成二氧化碳和水，并釋放出大量能量供機體利用。

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為了驗證這一猜想，作者通過Western Blot、電鏡、免疫熒光檢測和生化評估等實驗來檢測Mas1缺失的轉基因小鼠（Mas1-/-）和野生型小鼠（WT）被APAP刺激后的差異。首先，作者分析了自噬過程中相應標志物的蛋白表達，Western Blot結果顯示Mas1-/- APAP小鼠自噬、脂解和FAO受損，AKT增強和FOXO1信號通路受到抑制（圖4E）。另外，透射電子顯微鏡（TEM）檢測到Mas1-/- APAP小鼠自噬液泡（AVs）數(shù)量顯著減少（圖4F和G）。免疫熒光檢測顯示Mas1-/- APAP小鼠LDs顯著累積（BODIPY陽性點），同時脂噬（BODIPY/LAMP1共定位）和脂解（BODIPY/ATGL共定位）減少（圖4H-J）。在生化評估實驗中（圖4K）觀察到Mas1-/- APAP細胞中TG水平的顯著升高。以上實驗結果均表明Mas1-/- APAP小鼠自噬和FAO受損。

圖4.Mas1缺失實驗結果

除此之外，作者還發(fā)現(xiàn)給WT-APAP小鼠使用AVE0991后，自噬（TEM，圖5F）和脂噬（免疫熒光，圖5G）顯著上調，并伴有標記物的蛋白表達（WB，圖5H），表明自噬、脂噬和FAO恢復，AKT被抑制，F(xiàn)OXO1信號通路增強。

圖5.Mas激動劑（AVE0991）實驗結果

以上實驗均說明，Mas可能是通過影響AKT和FOXO1信號通路在DILI進程中發(fā)揮作用。為了進一步驗證作用機制的猜想，作者進行了多組學研究。轉錄組學中，與WT-APAP小鼠相比，WT-APAP+AVE0991小鼠脂肪酸降解和自噬途徑增強，脂滴途徑被抑制（圖6 I）。代謝組學中，使用AVE0991后，小鼠體內的一種與自噬密切相關的磷脂——磷脂酰乙醇胺（PE）水平升高（圖6J）。靶向組學中，通過量化肝內TAG、DAG、FFA和PE含量（圖6K和L），作者發(fā)現(xiàn)AVE0991可能會增強TAG的降解，釋放FFA用于后續(xù)的FAO。為了獲得AVE0991誘導的FAO調節(jié)的更直接證據，作者通過[U-13C]-棕櫚酸鹽轉化為13c標記的酰基肉堿和乙酰輔酶a來確定脂肪酸的代謝通量（圖6M）。數(shù)據顯示，棕櫚酰肉堿（C16）、肉豆蔻酰肉堿（C14）、桂酰肉堿（C12）和乙酰輔酶a的肝內豐度顯著增強（圖6N-P），說明AVE0991顯著增加了脂肪酸的體內周轉。

圖6.多組學實驗結果

為了進一步驗證脂噬和脂肪酸氧化是Mas的下游效應環(huán)節(jié)，作者給WT-APAP+AVE0991小鼠使用雷帕霉素（自噬激動劑）、非諾貝特（脂肪酸氧化激動劑）、lanifibranor（脂肪酸氧化激動劑）進行實驗，結果這些藥物顯著減輕了APAP誘導的肝損傷（圖7A，B）。而使用FAO的拮抗劑乙莫克舍后，小鼠的肝損傷顯著加重（圖7C，D）。

圖7.藥物實驗結果

作者通過給小鼠使用哌立福辛 （p-AKT的抑制劑）、AS1842856 （FOXO1的抑制劑）和去乙?；福ㄈヒ阴；傅囊种苿﹣矸治鯝KT和FOXO1的作用。在Mas1-/- APAP小鼠中，哌立福辛顯著減輕了肝毒性和TG積累，增加了FOXO1總蛋白表達，增強了自噬、脂噬和FAO（圖8A-C）。在WT-APAP小鼠中，AS1842856顯著降低了AVE0991的作用，并抑制了自噬、脂噬和FAO（圖8D-F）。相比之下，去乙?；革@著逆轉了Mas1-/- APAP小鼠的疾病表型，激活的FOXO1蛋白水平增加，自噬、脂解和FAO增強（圖8G-I）。此外，BODIPY/LAMP1的共定位證實了去乙?；冈鰪姷闹勺饔茫▓D8J）。以上實驗結果表明，APAP刺激后，Mas可能通過AKT和FOXO1信號通路調節(jié)脂噬和FAO。

圖8.抑制劑實驗結果

值得一提的是，作者使用了漢恒生物的攜帶Sh-Mas1的AAV2/8來抑制Mas基因的表達，觀察Mas基因在使用過量APAP刺激的小鼠（WT-Sh-Mas1）肝內和肝細胞中的作用，同時設置肝細胞特異性Mas1敲除（AlbcreMas1f/f）小鼠進行研究。結果顯示WT-Sh-Mas1（圖9A-E）和AlbcreMas1f/f（圖9F-I）肝毒性加重，脂噬和FAO受損，說明抑制肝細胞Mas表達或敲除Mas會抑制脂噬及FAO，加重肝損傷及炎癥。

圖9.Mas1缺失/敲除實驗結果

為了確定AKT和FOXO1的作用，作者設計了siAkt（圖10A-I）和siFoxo1（圖10J-P），以此在體外下調小鼠肝細胞中Mas信號相關基因的表達。從Mas1-/-小鼠獲得的原代肝細胞中，siAkt顯著誘導了指示標記物的蛋白表達，這表明APAP攻毒期間FOXO1信號通路被激活，自噬、脂解和FAO增強（圖10A）。說明siAkt顯著增加自噬、脂噬和FAO活性。相反，在WT小鼠獲得的原代肝細胞中，siFox 1大大降低了APAP攻毒期間AVE0991增強的脂噬和FAO（圖10J-P）。綜上所述，在APAP攻毒中，Mas激活通過抑制AKT信號通路和激活FOXO1信號通路來增強肝細胞的脂噬和FAO。

圖10. siAkt和siFoxo1實驗結果

在明確了Mas在DILI進程中作用機制的基礎上，作者就Mas在APAP誘導的小鼠肝毒性中的治療作用進行了研究。通過在APAP攻毒后的不同時間點給藥AVE0991，結果顯示攻毒2h后，AVE0991基本上恢復了受損的自噬和脂肪酸降解（圖11K, L），對比WT-APAP小鼠，使用AVE0991的小鼠存活率上升。但在攻毒24h后，AVE0991 對肝修復的影響不顯著，攻毒48h后，AVE0991仍未能在WT-APAP小鼠中顯示出保護作用。該實驗說明Mas在一定程度上可以保護小鼠免受APAP誘導的肝毒性，但其治療方法仍需進一步實驗測試。

圖11.APAP攻毒實驗結果

綜上，該研究闡明了Mas在DILI中的作用，肝細胞Mas敲除或缺失會下調AKT-FOXO1信號通路從而抑制脂噬以及下游脂肪酸氧化，進而加重肝損傷及驗證；相反，激活肝細胞中的Mas基因，則會上調AKT-FOXO1軸，脂噬以及下游脂肪酸氧化，減輕肝損傷及炎癥。因此，Mas有望成為DILI的一個新的治療靶點。

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（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36368597/）