? ? ? ? 從今天開始，介紹單鏈DNA病毒。今天介紹的病毒是腺相關(guān)病毒(Adeno Associated Virus/AAV/Adeno Associated?Dependoparvovirus)，她是在20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)的。與20世紀(jì)60年代比腺相關(guān)病毒更早被發(fā)現(xiàn)的細(xì)小病毒——鼠細(xì)小病毒(Minute virus of mice/MVM/Rodent protoparvovirus 1)一樣，都是細(xì)小病毒研究的熱點(diǎn)。

簡介

? ? ? ? 腺相關(guān)病毒(AAV)是感染人類和其他靈長類動物的小型病毒(直徑20nm)。它們屬于細(xì)小病毒家族的依賴病毒(Dependoparvovirus)，是復(fù)制缺陷的無包膜病毒。

? ? ? ? 目前尚不知道AAV會引起疾病，病毒僅引起非常輕微的免疫反應(yīng)。幾個特殊能力使AAV成為創(chuàng)建用于基因治療的病毒載體和創(chuàng)建同基因人類疾病模型的有吸引力的候選者。使用AAV的基因治療載體可以感染分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞，并以染色體外狀態(tài)持續(xù)存在而不整合到宿主細(xì)胞的基因組中，盡管在天然病毒中確實(shí)發(fā)生了病毒攜帶的基因整合到宿主基因組中的現(xiàn)象。整合對于某些應(yīng)用程序可能很重要，但也可能會帶來不良后果。最近使用AAV進(jìn)行視網(wǎng)膜基因治療的人類臨床試驗(yàn)顯示出了希望。

歷史

? ? ? ? 腺相關(guān)病毒(AAV)以前被認(rèn)為是腺病毒制劑中的一種污染物，在匹茲堡的Bob Atchison和NIH的Wallace Rowe的實(shí)驗(yàn)室中，最初被確認(rèn)為細(xì)小病毒。隨后對人體進(jìn)行的血清學(xué)研究表明，盡管AAV自身存在于被諸如腺病毒或皰疹病毒等輔助病毒感染的人中，但它本身并未引起任何疾病。

基因治療

優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

? ? ? ? 由于許多功能，野生型AAV已引起基因治療研究人員的極大興趣。 其中最主要的是病毒明顯缺乏致病性。 它也可以感染未分裂的細(xì)胞，并具有在人類19號染色體的特定位點(diǎn)(稱為AAVS1)穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中的能力。此功能使其比逆轉(zhuǎn)錄病毒更具可預(yù)測性，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有隨機(jī)插入和誘變的危險(xiǎn)，有時還會引起癌癥。 AAV基因組最常整合到上述位點(diǎn)，而隨機(jī)整合進(jìn)基因組的頻率可以忽略不計(jì)。 然而，作為基因治療載體的AAV的開發(fā)通過從載體DNA中去除rep和cap消除了這種整合能力。 所需基因與驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的啟動子一起插入反向末端重復(fù)序列(ITR)之間，該序列有助于單鏈載體DNA被宿主細(xì)胞DNA聚合酶復(fù)合物轉(zhuǎn)化為雙鏈后，在細(xì)胞核中形成串聯(lián)體。 脫氧核糖核酸?；贏AV的基因治療載體在宿主細(xì)胞核中形成游離型串聯(lián)體。在非分裂細(xì)胞中，這些級聯(lián)體在宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期內(nèi)保持完整。 在分裂細(xì)胞中，AAV DNA通過細(xì)胞分裂而丟失，因?yàn)橛坞xDNA不隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制。AAV DNA隨機(jī)整合到宿主基因組中是可以檢測到的，但發(fā)生頻率很低。AAVs的免疫原性也很低，似乎只限于中和抗體的產(chǎn)生，而它們卻沒有引起明確的細(xì)胞毒性反應(yīng)。此功能以及感染靜止細(xì)胞的能力，將其作為人類基因治療的載體，勝過腺病毒。

? ? ? ? 使用腺相關(guān)病毒確實(shí)存在一些缺點(diǎn)。載體的克隆能力相對有限，大多數(shù)治療性基因需要完全替代病毒的4.8kb基因組。 因此，大基因不適合用于標(biāo)準(zhǔn)AAV載體。當(dāng)前正在探索選擇方案來克服有限的編碼能力。兩個基因組的AAV ITR可以退火形成頭對尾的串聯(lián)體，幾乎使載體的容量增加了一倍，剪接位點(diǎn)的插入允許從轉(zhuǎn)錄本中除去ITR。

? ? ? ? 由于AAV在基因治療方面的優(yōu)勢，研究人員創(chuàng)建了AAV的一種變體，稱為自互補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)。 ?AAV包裝一條DNA單鏈，必須等待其第二條鏈合成，而scAAV包裝兩條彼此互補(bǔ)的較短鏈。通過避免第二鏈合成，scAAV可以更快地表達(dá)，盡管scAAV只能編碼已經(jīng)有限的AAV容量的一半。最近的報(bào)道表明，scAAV載體比腺病毒載體更具免疫原性，可誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活化。

? ? ? ? 由野生型感染引起的體液免疫被認(rèn)為是非常普遍的事件。 相關(guān)的中和活性限制了某些應(yīng)用中最常用的血清型AAV-2的用途。 因此，目前正在進(jìn)行的大多數(shù)臨床試驗(yàn)都涉及將AAV-2遞送到大腦中，這是一個具有相對免疫功能的器官。 在大腦中，AAV-2具有強(qiáng)烈的神經(jīng)元特異嗜性。

臨床實(shí)驗(yàn)

? ? ? ? 迄今為止，AAV載體已在全球超過117個臨床試驗(yàn)中使用，約占病毒載體基因治療試驗(yàn)的5.6％。最近，從1期和2期試驗(yàn)中獲得了許多疾病的令人鼓舞的結(jié)果，包括萊伯先天性黑病，血友病，充血性心力衰竭，脊髓性肌萎縮，?脂蛋白脂肪酶缺乏癥和帕金森氏病。

結(jié)構(gòu)

? ? ? ? AAV基因組由正鏈或負(fù)鏈的單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)構(gòu)建，長約4.7千堿基。 基因組包括在DNA鏈兩端的反向末端重復(fù)序列(ITR)，以及兩個開放閱讀框(ORF)：rep和cap。 前者由編碼AAV生命周期所需的Rep蛋白的四個重疊基因組成，后者包含衣殼蛋白的重疊核苷酸序列：VP1，VP2和VP3，它們相互相互作用形成二十面體對稱的衣殼。

? ? ? ? ?反向末端重復(fù)(ITR)序列各包含145個堿基。 它們之所以如此命名，是因?yàn)樗鼈兊膶ΨQ性，這被證明是有效擴(kuò)增AAV基因組所必需的。這些賦予它們這種特性的序列的特征是它們形成發(fā)夾的能力，這有助于所謂的自引發(fā)，該自引發(fā)使第二條DNA鏈不依賴于酶進(jìn)行合成。ITR是將AAV DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組(人類19號染色體)并從中拯救的必要條件，以及將AAV DNA進(jìn)行有效的衣殼化和結(jié)合完全組裝的抗DNA水解酶的AAV顆粒的制備。

? ? ? ?關(guān)于基因治療，ITR似乎是順式治療基因唯一需要的序列：結(jié)構(gòu)蛋白(cap)和包裝蛋白(rep)可以反式提供。 在這種假設(shè)下，建立了許多有效生產(chǎn)含有報(bào)告基因或治療基因的重組AAV(rAAV)載體的方法。 但是，也有報(bào)道稱，ITR不是順式有效復(fù)制和衣殼化所需的唯一元素。 一些研究小組已經(jīng)在rep基因的編碼序列內(nèi)鑒定出一個稱為順式作用Rep依賴元件(CARE)的序列。當(dāng)在順式中存在時，CARE顯示出增加復(fù)制和衣殼化的作用。

? ? ? ? 在基因組的“左側(cè)”有兩個稱為p5和p19的啟動子，從中可以產(chǎn)生兩個重疊的長度不同的mRNA。 這些中的每一個都包含一個內(nèi)含子，該內(nèi)含子可以被剪接或不被剪接。 考慮到這些可能性，可以合成四個不同的mRNA，從而合成四個具有重疊序列的Rep蛋白。 它們的名稱以千道爾頓(kDa)表示它們的大?。篟ep78，Rep68，Rep52和Rep40。Rep78和68可以以自吸方式特異性結(jié)合由ITR形成的發(fā)夾，并在發(fā)夾內(nèi)的特定區(qū)域(指定為末端分辨位點(diǎn))處裂解。 還顯示它們對于AAVS基因組的AAVS1特異性整合是必需的。 顯示所有四個Rep蛋白都結(jié)合ATP并具有解旋酶活性。還顯示它們上調(diào)了來自p40啟動子的轉(zhuǎn)錄，但是會下調(diào)p5和p19啟動子轉(zhuǎn)錄。

? ? ? ? ?基因組的右側(cè)編碼三個衣殼蛋白VP1，VP2和VP3的重疊序列，它們從一個啟動子p40開始。 這些蛋白質(zhì)的分子量分別為87、72和62kDa。AAV衣殼由VP1，VP2和VP3的混合物組成，總共60種以二十面體對稱形式以1：1：10的比例排列的單體，估計(jì)大小為3.9 MDa。 科學(xué)家們后來確定了VP3蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。

? ? ? ? cap基因會產(chǎn)生另一種非結(jié)構(gòu)蛋白，稱為組裝激活蛋白(AAP)。這種蛋白質(zhì)是由ORF2產(chǎn)生的，對于衣殼組裝過程至關(guān)重要。迄今為止，該蛋白質(zhì)在組裝過程中的確切功能及其結(jié)構(gòu)尚未得到解決。

? ? ? ? 所有三個VP均由一種mRNA翻譯而成。 合成此mRNA后，可以用兩種不同的方式進(jìn)行剪接：可以切除更長或更短的內(nèi)含子，從而形成兩個mRNA池：一個2.3 kb和一個2.6 kb長的mRNA池。 通常，特別是在腺病毒存在的情況下，優(yōu)選較長的內(nèi)含子，因此2.3kb長的mRNA代表所謂的“主要剪接”。 以這種形式，切除了從其開始合成VP1蛋白的第一個AUG密碼子，導(dǎo)致VP1蛋白合成的總體水平降低。 保留在主要剪接物中的第一個AUG密碼子是VP3蛋白的起始密碼子。 但是，在同一開放閱讀框中該密碼子的上游是一個ACG序列(編碼蘇氨酸)，該序列被最佳的Kozak元件包圍，這導(dǎo)致VP2蛋白的合成水平降低。實(shí)際上，VP2蛋白是具有額外N末端殘基的VP3蛋白；VP1蛋白是具有額外N末端殘基的VP2蛋白。

? ? ? ? 由于優(yōu)選剪接較大的內(nèi)含子，并且由于在主要剪接中ACG密碼子的翻譯起始信號弱得多，所以體內(nèi)合成AAV結(jié)構(gòu)蛋白的比例約為1：1：10，這與成熟病毒粒子相同。VP1蛋白N末端的獨(dú)特片段顯示具有磷脂酶A2(PLA2)活性，這可能是晚期內(nèi)體釋放AAV顆粒所必需的。Muralidhar等人報(bào)告說，VP2和VP3對于正確的病毒粒子裝配至關(guān)重要。然而，最近沃靈頓等人表明VP2對于完整的病毒顆粒形成和有效的感染力是不必要的，并且還提出VP2可以耐受其N末端的大插入，而VP1則不能，這可能是由于PLA2域的存在。

腺相關(guān)病毒的DNA復(fù)制過程

? ? ? 腺相關(guān)病毒DNA復(fù)制為滾叉復(fù)制(Rolling hairpin Replication)。

? ? ? 腺相關(guān)病毒基因組是具有末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA。感染后，3'發(fā)夾用作宿主修復(fù)酶的引物，將病毒的ssDNA轉(zhuǎn)化為用于轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的dsDNA形式。

? ? ? ?復(fù)制在細(xì)胞周期的S階段處于活動狀態(tài)。它由稱為rep或NS1的病毒核酸內(nèi)切酶起始，在發(fā)夾和編碼序列之間形成缺口。這將產(chǎn)生一個3'端，以引發(fā)鏈置換復(fù)制并開始滾動發(fā)夾復(fù)制，并產(chǎn)生等量的ssDNA+和ssDNA-。

病毒分類

? ? ? ?2013年，國際病毒分類委員會認(rèn)可了兩種AAV：腺相關(guān)病毒血清型A(AAV-1、AAV-2、AAV-3和AAV-4)和腺相關(guān)病毒血清型B(AAV-5)。?

? ? ?? 直到1990年代，幾乎所有AAV生物學(xué)都使用AAV-2進(jìn)行了研究。但是，AAV在人類和其他靈長類動物中非常流行，并且已經(jīng)從各種組織樣本中分離出了幾種血清型。 在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了AAV-2、AAV-3、AAV-5和AAV-6，在非人類靈長類動物樣本中發(fā)現(xiàn)了AAV-1、AAV-4、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。截至2006年，已經(jīng)描述了11種AAV血清型。AAV衣殼蛋白包含12個高變表面區(qū)域，大多數(shù)變異發(fā)生在三重近端峰中，但是細(xì)小病毒基因組通常在不同血清型之間呈現(xiàn)高度保守的復(fù)制和結(jié)構(gòu)基因。所有已知的血清型都可以感染多種不同組織類型的細(xì)胞。 組織特異性由衣殼血清型決定，改變其嗜性范圍的AAV載體假型化可能對它們在治療中的應(yīng)用很重要。

腺相關(guān)病毒2型

? ? ? ?迄今為止，AAV-2受到了最廣泛的應(yīng)用。AAV-2對骨骼肌，神經(jīng)元，血管平滑肌細(xì)胞和肝細(xì)胞具有天然的嗜性。

? ? ?? 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了AAV-2的三種細(xì)胞受體：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，αVβ5整聯(lián)蛋白和成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR-1)。前者起主要受體的作用，而后兩者具有共受體活性，并使AAV通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。邱漢達(dá)等對這些研究結(jié)果提出了質(zhì)疑。HSPG充當(dāng)主要受體，盡管其在細(xì)胞外基質(zhì)中的豐度可以清除AAV顆粒

其他類型

? ? ? ? 盡管在各種基于AAV的研究中AAV-2是最流行的血清型，但已顯示其他血清型作為基因傳遞載體可能更有效。例如，AAV-6在感染氣道上皮細(xì)胞方面表現(xiàn)更好，AAV-7表現(xiàn)出非常高的鼠骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率(類似于AAV-1和AAV-5)，AAV-8在轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞方面表現(xiàn)出色以及AAV-1和-5在將基因傳遞到血管內(nèi)皮細(xì)胞方面非常有效。在大腦中，大多數(shù)AAV血清型顯示神經(jīng)元嗜性，而AAV-5也轉(zhuǎn)導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞。AAV-1和AAV-2的混合體AAV-6的免疫原性也低于AAV-2。

? ? ? ? 血清型在結(jié)合它們的受體方面可以不同。 例如，AAV-4和AAV-5的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以被可溶性唾液酸(每種血清型不同的形式)抑制，AAV-5被證明通過血小板衍生的生長因子受體進(jìn)入細(xì)胞。

人造病毒

? ? ? ? 為了臨床和研究目的，已經(jīng)進(jìn)行了許多努力來設(shè)計(jì)和改進(jìn)新的AAV變體。 此類修飾包括靶向特定組織的新向性和修飾的表面殘留物，以逃避免疫系統(tǒng)的檢測。 除了選擇針對特定細(xì)胞的重組AAV(rAAV)特定菌株外，研究人員還探索了AAV假型化方法，即創(chuàng)建某些AAV菌株雜種以逼近更精細(xì)目標(biāo)的實(shí)踐。 通過從一個菌株中提取衣殼，并從另一菌株中提取基因組來產(chǎn)生雜種。例如，涉及AAV-2/5(與AAV-2的基因組和AAV-5的衣殼混合的雜交)的研究比AAV-2能夠?qū)崿F(xiàn)非雜化，能夠在腦細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)更高的準(zhǔn)確性和范圍。 研究人員通過創(chuàng)建帶有混合衣殼的菌株，繼續(xù)進(jìn)行假型試驗(yàn)。AAV-DJ具有來自八種不同AAV菌株的混合衣殼；因此，它可以感染人體許多區(qū)域的不同細(xì)胞，這是單向性有限的AAV毒株所不具備的。設(shè)計(jì)和改進(jìn)新的AAV變體的其他工作涉及祖先重建病毒變體，以產(chǎn)生具有增強(qiáng)特性的新載體，用于臨床應(yīng)用和AAV生物學(xué)研究。

免疫學(xué)研究

? ? ?? 由于AAV在人體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力明顯有限，因此AAV在基因治療師中特別受關(guān)注，AAV是一種應(yīng)積極影響載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率同時降低任何免疫相關(guān)病理風(fēng)險(xiǎn)的因素。

? ? ? ?人們認(rèn)為AAV在疾病中沒有任何已知作用。

先天

? ? ? ?在動物模型中已經(jīng)表征了對AAV載體的先天免疫應(yīng)答。 小鼠靜脈內(nèi)給藥可引起促炎性細(xì)胞因子的瞬時產(chǎn)生，以及嗜中性粒細(xì)胞和其他白細(xì)胞向肝臟的某些浸潤，這似乎可以隔離大部分注射的病毒顆粒。溶源性因子水平和細(xì)胞浸潤似乎都在六個小時內(nèi)恢復(fù)到基線。 相比之下，更具攻擊性的病毒會產(chǎn)生持續(xù)24小時或更長時間的固有反應(yīng)。

體液

? ? ? ? 已知該病毒會在動物模型和人群中激發(fā)強(qiáng)大的體液免疫力，據(jù)認(rèn)為高達(dá)80％的個體對AAV-2呈血清反應(yīng)陽性。 已知抗體是中和的，對于基因治療應(yīng)用，它們確實(shí)會通過某些給藥途徑影響載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 除了持久的AAV特異性抗體水平外，在動物的初免-升壓研究和臨床試驗(yàn)中，B細(xì)胞的記憶力都很強(qiáng)。在血清反應(yīng)陽性的人中，AAV-2的循環(huán)IgG抗體似乎主要由IgG1和IgG2亞類組成，幾乎沒有或沒有IgG3或IgG4。

細(xì)胞介導(dǎo)

? ? ? ?細(xì)胞介導(dǎo)的對病毒和載體的反應(yīng)的特性較差，直到2005年文獻(xiàn)中才被忽略。使用基于AAV-2的載體治療B型血友病的臨床試驗(yàn)似乎表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的靶向破壞可能正在發(fā)生。結(jié)合數(shù)據(jù)顯示CD8+T細(xì)胞可以在體外識別AAV衣殼的元件，似乎可能存在對AAV載體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 細(xì)胞毒性反應(yīng)將暗示CD4+輔助T細(xì)胞參與了對AAV的反應(yīng)，人體研究的體外數(shù)據(jù)表明該病毒確實(shí)可能誘導(dǎo)此類反應(yīng)，包括Th1和Th2記憶反應(yīng)。在AAV衣殼蛋白VP1中已鑒定出許多刺激T細(xì)胞的抗原決定簇，如果將該病毒用作基因治療的載體，這可能是修飾衣殼的誘人靶點(diǎn)。

感染循環(huán)

? ? ? ? 從感染細(xì)胞到產(chǎn)生新的感染性顆粒，AAV感染周期有幾個步驟：

1.附著于細(xì)胞膜

2.受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

3.內(nèi)體運(yùn)輸

4.從晚期內(nèi)體或溶酶體逃逸

5.易位至核

6.脫膜

7.AAV基因組的雙鏈DNA復(fù)制形式的形成

8.rep基因的表達(dá)

9.基因組復(fù)制

10.cap基因的表達(dá)，后代ssDNA顆粒的合成

11.組裝完整的病毒粒子

12.病毒從被感染的細(xì)胞中釋放出來。

? ? ? ? 這些步驟中的某些步驟在各種類型的細(xì)胞中可能看起來有所不同，這部分地有助于AAV的定義性和十分有限的天然向性性。 病毒的復(fù)制也可以在一種細(xì)胞類型中變化，具體取決于細(xì)胞當(dāng)前的細(xì)胞周期階段。

? ? ? ? 腺相關(guān)病毒的特征是復(fù)制缺陷，因此無法在未受影響的細(xì)胞中繁殖。腺相關(guān)病毒通過與輔助病毒共同感染細(xì)胞而傳播。被描述為能夠成功產(chǎn)生新的AAV粒子的第一個輔助病毒是腺病毒，這也就是腺相關(guān)病毒名字的由來。然后表明，可以通過選自腺病毒基因組的選定蛋白，其他病毒(例如皰疹病毒、痘苗病毒或乳頭瘤病毒)或遺傳毒劑(例如紫外線輻射或羥基脲)來促進(jìn)AAV復(fù)制。根據(jù)是否存在輔助病毒，AAV的生命周期分別遵循裂解途徑或溶源途徑。如果存在輔助病毒，則AAV的基因表達(dá)會被激活，從而使病毒可以使用宿主細(xì)胞的聚合酶進(jìn)行復(fù)制。當(dāng)輔助病毒殺死宿主細(xì)胞時，將釋放新的AAV病毒體。如果不存在輔助病毒，則AAV表現(xiàn)為溶源性行為。當(dāng)AAV單獨(dú)感染細(xì)胞時，其基因表達(dá)被抑制(AAV不復(fù)制)，其基因組被整合到宿主基因組中(進(jìn)入人類19號染色體)。

? ? ? ? 在極少數(shù)情況下，AAV可在沒有輔助病毒的情況下自行復(fù)制，但通常AAV無法自行復(fù)制和殺死細(xì)胞。

? ? ? ?Matsushita與Ellinger等人發(fā)現(xiàn)了有效生成子代AAV顆粒所需的最小腺病毒基因集。 該發(fā)現(xiàn)允許重組AAV的新生產(chǎn)方法，其不需要腺病毒共感染AAV生產(chǎn)細(xì)胞。在沒有輔助病毒或遺傳毒性因子的情況下，AAV DNA可以整合到宿主基因組中或以游離形式存在。 在前一種情況下，整合是由Rep78和Rep68蛋白介導(dǎo)的，并且需要在整合區(qū)域兩側(cè)存在ITR。在小鼠中，已觀察到AAV基因組以游離形式(環(huán)狀首尾構(gòu)象)在靜態(tài)組織(例如骨骼肌)中長期存在。

? ? ? ?下期要介紹的病毒是第一個與人類疾病有關(guān)的細(xì)小病毒——細(xì)小病毒B19，敬請期待！