前言

銀屑病關(guān)節(jié)炎（PsA）與許多免疫細(xì)胞群的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，目前已知PsA與CD8+T細(xì)胞（尤其是產(chǎn)生IL-17）有關(guān)。本篇研究通過(guò)質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF）結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，測(cè)量PsA、SF和血白細(xì)胞的高維數(shù)據(jù)集，并鑒定炎性蛋白（骨橋蛋白和CCL2）。無(wú)任何體外刺激條件下定量分析SF蛋白，以確定髓源性介質(zhì)在PsA發(fā)病機(jī)制中的作用。

2021年12月,由英國(guó)牛津大學(xué)納菲爾德骨科、風(fēng)濕病學(xué)和肌肉骨骼學(xué)院Nicole Yager、Paul Bowness教授課題組在國(guó)際風(fēng)濕病頂級(jí)期刊Annals Of The Rheumatic Diseases期刊（IF:27.973）發(fā)表了題為 “Ex vivo mass cytometry analysis reveals a profound myeloid proinflammatory signature in psoriatic arthritis synovial fluid”的研究成果，通過(guò)質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)了骨橋蛋白和CCL2的特征，探究了PsA的炎癥機(jī)理，描繪了PsA SF和血液的綜合細(xì)胞圖譜。為PsA診斷和治療提供了理論依據(jù)。

研究思路

研究方法

1、實(shí)驗(yàn)分組/研究材料

（1）實(shí)驗(yàn)組：11名（6名男性，5名女性，未接受生物DMARDS或類固醇治療的連續(xù)患者，4名甲氨蝶呤治療的患者）采集血液和SF；其中3名患者進(jìn)行PCR陣列評(píng)估，3名患者進(jìn)行scRNA測(cè)序，另外3名患者進(jìn)行靶向SF和血漿蛋白分析

（2）對(duì)照組：15名健康者（10名男性，5名女性）采集血液

2、技術(shù)路線

2.1細(xì)胞因子染色和分析:?Maxpar、ConsensusClusterPlus和FlowSOM法

2.2 PCR陣列：RNeasy Micro kit（Qiagen）、定制384基因陣列（RT2）、ΔΔCt方法計(jì)算SF血樣

2.3 定量骨橋蛋白：LEGENDplex、人骨橋蛋白ELISA

2.4 scRNA測(cè)序分析：Seurat識(shí)別分析聚髓細(xì)胞簇

3、統(tǒng)計(jì)分析

Benjamini-Hochberg、Wilcox、BioLegend

研究結(jié)果

1. 與PsA血相比，PsA SF顯示特異性髓細(xì)胞量顯著增加

對(duì)11名PsA患者的SF和血液進(jìn)行細(xì)胞因子分析，通過(guò)主成分分析（PCA）可顯著區(qū)分PsA、SF樣品與血液（圖1）。無(wú)偏聚類算法FlowSOM觀察到細(xì)胞間的明顯差異。在PsA SF中，中間體單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、cDC1、cDC2、CD206+cDC2、pDC、記憶CD8 T細(xì)胞、記憶CD4T細(xì)胞和CD56bright NK細(xì)胞顯著增加；非經(jīng)典單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、初始CD8 T細(xì)胞、初始 CD4 T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD56dim CD16+NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞則顯著減少（圖2）。

圖1 | PsA滑液（SF）、血液的實(shí)驗(yàn)流程和主成分分析

圖2 | PsA SF CyTOF分析細(xì)胞組群適應(yīng)性

11例PsA患者中有4例服用甲氨蝶呤，對(duì)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞沒(méi)有影響，而cDc1、CD206+cDC2及CD56dim ?CD16+NK細(xì)胞增加，激活的記憶性CD8 T細(xì)胞減少。與血液相比，甲氨蝶呤并不影響PsA SF的總體升高/降低。將健康血液與PsA血液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PsA血液中pDC和MAIT細(xì)胞的頻率降低(補(bǔ)充圖S1)。

2. PsA SF中擴(kuò)展多個(gè)記憶T細(xì)胞亞群

與血液相比，PsA SF中PD1hi記憶CD4 T細(xì)胞，PD1mid記憶CD4 T細(xì)胞、CD25hi記憶CD4 T細(xì)胞、CD49a+記憶CD8 T細(xì)胞群顯著增加，并采用FlowSOM對(duì)細(xì)胞群聚類分析（補(bǔ)充圖S2）。

3. PsA SF髓樣細(xì)胞在體外孵育時(shí)自發(fā)釋放促炎蛋白

體外孵育SF和PsA患者的血液，并將匹配的樣品進(jìn)行比較。除了18種細(xì)胞表面譜系標(biāo)記物，還包括18種細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物以檢測(cè)細(xì)胞因子、趨化因子和其他分泌蛋白，包括IFNg、IL-4、IL-10、IL-17和IL-21（主要由T細(xì)胞分泌）以及IL-8、CCL2、CXCL10、骨激活素和骨橋蛋白（主要為髓樣細(xì)胞）。采用FlowSOM對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行聚類分析，在經(jīng)典單核細(xì)胞、中間單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的SF中，骨橋蛋白、CCL2和IL-8在T6時(shí)均顯著增加。PsA血液中，由于中間單核細(xì)胞太少，無(wú)法分析單核細(xì)胞（圖3A、補(bǔ)充圖S3A-3B、S6和補(bǔ)充表S3）。

PsA SF中的 CD11c+CD14 + CD123- 細(xì)胞在6小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生了骨橋蛋白、CCL2和IL-8。但在血液中僅檢測(cè)到少量骨橋蛋白，SF單核細(xì)胞中CCL2和IL-8顯著高于血單核細(xì)胞（圖3C-D），SF單核細(xì)胞中產(chǎn)生較高的CXCL10和骨化素（補(bǔ)充圖S7）。T細(xì)胞因子在6小時(shí)期間釋放的信息發(fā)現(xiàn)，SF MAIT細(xì)胞中IL-10的表達(dá)增加了95%（補(bǔ)充圖S5）。選用PMA /離子型霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，顯示了T細(xì)胞的召回能力和產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力（補(bǔ)充圖S8）。

圖3 | PsA SF單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在離體6小時(shí)內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生骨橋蛋白、CCL2和IL-8（CXCL8）

4. 與匹配的PBMCs相比，SPP1和CCL2在SF T細(xì)胞和單核細(xì)胞的基因表達(dá)中均上調(diào)

從匹配的PBMC和SF樣本中提取CD14 +細(xì)胞、記憶CD8 T細(xì)胞和記憶CD4 T細(xì)胞，三種細(xì)胞類型與血液相比，發(fā)現(xiàn)SF失調(diào)的基因表達(dá)上調(diào)（圖4B）。在SF CD14 +細(xì)胞中，骨橋蛋白基因SPP1是上調(diào)最高的基因。CD14+細(xì)胞中CCL2和CXCL10同時(shí)上調(diào)，但CXCL8 （IL-8基因）未上調(diào)。CyTOF數(shù)據(jù)集中，盡管OLR1和TNF顯著上調(diào)，但相應(yīng)的蛋白沒(méi)有顯著增加（圖4C）。

PsA PBMCs中的基因表達(dá)與對(duì)照樣本比對(duì)（補(bǔ)充圖S9A）。SPP1和CCL2僅在PsA SF與PsA血中上調(diào)，而在PsA血中和健康血中無(wú)顯著差異。與健康血液相比，PsA SF中CXCL10 IL上調(diào)，但在PsA血中下調(diào)（補(bǔ)充圖S9B）。與血漿相比，SF中骨橋蛋白、CCL2和IL-8均富集（圖4D）。對(duì)血液和SF的單核/巨噬細(xì)胞簇，進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)SPP1上調(diào)最多。SF中的SPP1和CCL2均在多個(gè)細(xì)胞群中表達(dá)，但表達(dá)水平相對(duì)較低。CyTOF數(shù)據(jù)中，SF的單核/巨噬細(xì)胞群體的細(xì)胞因子、趨化因子基因上調(diào)最高（圖5）。

圖4 | 分析PsA SF CD14+細(xì)胞、記憶CD8+T細(xì)胞和記憶CD4+T細(xì)胞基因

圖5 | PsA SFMC的scRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中骨橋蛋白和CCL2基因高度上調(diào)

相關(guān)討論

通過(guò)基因水平證實(shí)，在新分類的PsA SF CD14單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和scRNAseq數(shù)據(jù)集中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的SPP1（骨橋蛋白的基因）上調(diào)最高。SF T細(xì)胞中，CyTOF沒(méi)有檢測(cè)到骨橋蛋白，而骨橋SF CD4 T細(xì)胞中也沒(méi)有CXCL13。PsA單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了IL-8（CXCL8），但血液中的含量高于SF，說(shuō)明滑膜組織細(xì)胞或中性粒細(xì)胞可能是PsA的主要來(lái)源。

研究結(jié)論

通過(guò)質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF）結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有任何體外刺激的情況下，經(jīng)典單核細(xì)胞、中間單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會(huì)自發(fā)產(chǎn)生大量的促炎介質(zhì)骨橋蛋白和CCL2?；虮磉_(dá)分析PsA 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)基因顯著上調(diào)的骨橋蛋白和CCL2，且這兩種蛋白質(zhì)在PsA SF中也顯著升高。生成的PsA SF和血液的綜合細(xì)胞圖譜，揭示了PsA 中具有潛在致病性和治療重要性的關(guān)鍵骨髓促炎模塊。

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質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合組學(xué)分析技術(shù)揭示了銀屑病關(guān)節(jié)炎滑液中的骨髓促炎特征，生成的PsA SF、血液白細(xì)胞高維數(shù)據(jù)圖譜，體外識(shí)別了淋巴和骨髓細(xì)胞因子。研究分析，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的抑制療法，是引發(fā)PsA炎癥的因素之一；骨橋蛋白和CCL2兩種蛋白對(duì)PsA診斷和治療有一定作用。?

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