相信大家都有「傷口愈合」的經(jīng)歷：劃破的傷口幾天后就愈合了。在這過程中細(xì)胞遷移（Cell migration）功能起到了很大的作用。

細(xì)胞遷移是多細(xì)胞生物發(fā)育和存活關(guān)鍵的生物學(xué)過程，是細(xì)胞運(yùn)動的表型之一。胚胎發(fā)育時器官的形成、傷口的愈合、免疫應(yīng)答等都需要細(xì)胞非常精準(zhǔn)的遷移到特定部位，就連威脅人體健康的癌癥轉(zhuǎn)移少不了細(xì)胞遷移。

一直以來科學(xué)家們都試圖通過對細(xì)胞遷移的研究，以期在阻止癌癥轉(zhuǎn)移、植皮等醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面取得更大成果。其中，「細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)」是目前最為簡單經(jīng)濟(jì)，用于研究細(xì)胞遷移的體外方法。

然而看似簡單“劃痕”實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)操作中也會栽跟頭，狀況百出，如細(xì)胞鋪板數(shù)量過多/過少，劃痕不均一，細(xì)胞不遷移，如何進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等諸多問題。在此，基于自己前期的一些失敗的教訓(xùn)，給大家做一點(diǎn)總結(jié)。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的基本概念

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外實(shí)驗(yàn)方法。

這種方法的原理是，當(dāng)細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白無細(xì)胞區(qū)域（稱為“劃痕”），然后對這個無細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行觀察。

如果這些劃痕邊緣的細(xì)胞逐漸進(jìn)入空白無細(xì)胞區(qū)域，使“劃痕”愈合，說明細(xì)胞有遷移能力。因這個過程類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實(shí)驗(yàn)（Wound-Healing Assay）。如下圖所示：

優(yōu)點(diǎn)：
??????1）一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程；
??????2）適合研究細(xì)胞與胞外基質(zhì)（ECM）、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用引起的細(xì)胞遷移。
??????3）配合活細(xì)胞顯微成像可用于分析細(xì)胞間的相互作用。
??????4）成本低、操作簡單。

該實(shí)驗(yàn)方法常用于研究腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和細(xì)胞基質(zhì)對于細(xì)胞遷移的影響，廣泛用于可以觀察藥物、基因等外源因素對細(xì)胞遷移和修復(fù)的影響。

平板劃痕實(shí)驗(yàn)步驟

在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時間（可有不同時間點(diǎn)），取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下進(jìn)行拍照記錄，獲得多個時間點(diǎn)的圖片序列，之后定時測量劃痕的寬度，進(jìn)而得到傷口愈合的細(xì)胞遷移數(shù)據(jù)。

該實(shí)驗(yàn)適用于檢測培養(yǎng)的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞），不適用于檢測組織樣本。

并非所有細(xì)胞都適合劃痕實(shí)驗(yàn)，以乳腺癌為例，乳腺癌細(xì)胞MCF-7幾乎很難遷移，而MDA-MB-231具有很強(qiáng)遷移性。

所以，細(xì)胞的選擇需要考慮細(xì)胞自身的遷移能力，一般需要遷移強(qiáng)的細(xì)胞，而且對無血清的環(huán)境有較強(qiáng)的忍受力（至少24h）。然而很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下，12h細(xì)胞凋亡就超過50%，因此細(xì)胞劃痕法對部分腫瘤細(xì)胞并不適用。

【實(shí)驗(yàn)材料】做細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，基本上不需要額外買設(shè)備

① 細(xì)胞培養(yǎng)平板，一般使用6孔板，大小合適，便于劃線和觀察（6孔板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，而且因?yàn)橛?條定位線，與劃痕相交，這樣就有10個可固定監(jiān)測點(diǎn)，以解決了前后觀察時位置不固定的問題）；

② marker筆，用于標(biāo)記；

③ 直尺，用于觀察時對細(xì)胞劃痕寬度測量；

④ 20微升槍頭，用于在單層細(xì)胞上劃痕；

⑤ 無血清培養(yǎng)基

⑥ PBS

注：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前于超凈工作臺內(nèi)紫外線消毒至少30min。

【具體操作步驟】

（1）培養(yǎng)板劃線標(biāo)記

首先使用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃平行線（線要直），各水平線間的間距為0.5-1cm，每孔至少畫5條水平線，方便之后鏡下觀察每個區(qū)域。劃線時注意線不要太粗。

（2）細(xì)胞鋪板

胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪板，保證每組細(xì)胞鋪板密度一致，一般在孔內(nèi)接種約5-10×105個細(xì)胞（可根據(jù)細(xì)胞的生長快慢調(diào)整接種數(shù)量）。

Tips：

• 實(shí)驗(yàn)時應(yīng)注意細(xì)胞生長狀況，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。對不同類型細(xì)胞要觀察細(xì)胞貼壁率等，確定實(shí)驗(yàn)時細(xì)胞種板數(shù)量和培養(yǎng)時間，保證培養(yǎng)終止時密度適當(dāng)。為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可在做實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)。

• 細(xì)胞種板密度原則為過夜后融合率達(dá)到100%。若過夜后細(xì)胞未100%融合，雖可以適當(dāng)延長培養(yǎng)時間，但因細(xì)胞密度已經(jīng)很大，所以細(xì)胞狀態(tài)會逐漸變差，后續(xù)細(xì)胞可能不遷移而是凋亡。

• 一定要等到細(xì)胞鋪滿，彼此之間沒有空隙，否則會影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

（3）制造劃痕

待細(xì)胞鋪滿后，用直尺比著，使用20ul槍頭垂直于孔板和線制造細(xì)胞劃痕，使劃痕與標(biāo)記線相交。

Tips：

• 槍頭要垂直，不要傾斜。

• 盡量保證各個劃痕寬度一致。①不同孔之間最好使用同一只槍頭。②最好保持力度一致，盡量一次性劃完。

• 按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測點(diǎn)，以解決前后觀察時位置不固定的問題，確保拍照觀察點(diǎn)固定。例如劃痕一次與5條定位線相交，就有10個監(jiān)測點(diǎn)

• 手動劃痕，難以保證劃痕寬度的一致性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有時候在劃細(xì)胞的同時會刮壞一片細(xì)胞，對劃痕的邊緣的細(xì)胞造成機(jī)械損傷。有條件的話，可選擇culture Insert，將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。細(xì)胞長滿Insert 區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500μm寬度的劃痕。

（4）洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞，換液

劃痕完成后用顯微鏡照相，作為0h對照。吸去舊培養(yǎng)基，再使用無菌PBS洗細(xì)胞3次，洗去劃下的細(xì)胞，使留下的間隙肉眼即清晰可見。然后加入新鮮無血清或低血清（<2%）的培養(yǎng)基。

根據(jù)需要設(shè)加實(shí)驗(yàn)組、對照組。不需加藥的空白對照組只需添加等量的無血清培養(yǎng)基即可，藥物干預(yù)組加入含藥物的無血清培養(yǎng)基

Tips：

• 在用PBS緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞；反復(fù)多次沖洗，盡量洗掉所有的細(xì)胞碎片，否則會影響拍照效果。

• 為了避免細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響，盡量不要用吸泵，可用移液槍緩慢吸走。

• 劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細(xì)胞遷移。如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素（1μg/ml）處理1h，抑制細(xì)胞的分裂，這樣結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。

• 另外，劃出劃痕后，把培養(yǎng)基換成無血清的培養(yǎng)基（有的細(xì)胞對無血清不耐受，可以少加點(diǎn)血清，維持細(xì)胞的狀態(tài)），可以降低增殖對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會慢很多。

（5）細(xì)胞培養(yǎng)與定時拍照觀察

將細(xì)胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r間點(diǎn)（根據(jù)個人實(shí)驗(yàn)需要）取出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察劃痕寬度并拍照。

Tips：

• 一般按0，6，12，24小時拍照，建議不要把觀察時間設(shè)置的太長，因?yàn)楹苋菀自斐杉?xì)胞污染死亡或者過度增殖造成的假陽性結(jié)果。

• 以預(yù)先做好的標(biāo)記為定點(diǎn)觀測點(diǎn)來進(jìn)行定時拍照（選擇處理/對照組遷移能力差異明顯的時間點(diǎn)拍照，拍攝與0h拍照時的相同位置，放大倍數(shù)相同）。

• 拍照時標(biāo)記線不要出現(xiàn)在視野內(nèi)，而是剛好沿著標(biāo)記線的邊拍照。

• 細(xì)胞生長具有邊緣效應(yīng)，所以邊緣細(xì)胞生長狀態(tài)可能與中間的細(xì)胞不太一樣，不宜作為觀測點(diǎn)。

（6）數(shù)據(jù)分析

劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析主要有兩種方法，一種是統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移的距離；一種是統(tǒng)計(jì)劃痕面積。

①細(xì)胞遷移距離：通過對初始劃線（0h）和后期觀察點(diǎn)的劃痕的距離對比來判斷。②劃痕面積：通過對初始劃線（0h）和后期觀察點(diǎn)的劃痕的面積對比來判斷。

Tips：

• 隨著細(xì)胞的不斷遷移，劃痕會不斷縮小，在計(jì)算不同時間點(diǎn)劃痕寬度的縮小時，不要計(jì)算其相除的比例值，而是要計(jì)算相減的差值。

• 可以使用ImageJ（或Image Pro Plus）來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。

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