前言

2022年7月19日，浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院泌尿外科文甲明、王博涵團隊聯(lián)合西湖大學謝琦團隊，于Cell Discovery（IF：38.079）在線發(fā)表了腎透明細胞癌（ccRCC）的單細胞轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq）和單細胞轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序（scATAC-seq）的最新研究成果。研究人員對三名患者進行了配對的scRNA-seq和scATAC-seq，并對另外一名患者進行了單獨的scRNA-seq。該研究揭示了ccRCC的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組特征，有助于理解ccRCC的進展以及確定潛在的治療靶點。

研究背景

腎透明細胞癌（ccRCC）是腎細胞癌最常見和最具侵襲性的類型，超過三分之一的ccRCC患者在手術(shù)后復發(fā)并發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性ccRCC患者的預后差。ccRCC的微環(huán)境由多種不同的細胞類型和結(jié)構(gòu)成分組成，這些組成在癌癥進展和耐藥性中起關(guān)鍵作用，但ccRCC的細胞類型和潛在的基因調(diào)控特征尚不完全清楚。

本研究聯(lián)合單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）和單細胞轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序（scATAC-seq）揭示ccRCC的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組特征，闡明了ccRCC的細胞異質(zhì)性，鑒定出介導腫瘤發(fā)展和影響免疫細胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，并確定了ccRCC潛在的治療靶點。

期刊：Cell Discovery

影響因子：38.079

發(fā)表年月：2022年7月19日

材料：三名患者進行了配對的scRNA-seq和scATAC-seq，并對另外一名患者進行了單獨的scRNA-seq

運用歐易生物技術(shù)：10X Genomics高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和單細胞ATAC測序

研究結(jié)果

1、ccRCC中的單細胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性分析

為了系統(tǒng)地解析ccRCC的異質(zhì)性，研究對三名患者進行了配對的scRNA-seq和scATAC-seq，并對另外一名患者進行了單獨的scRNA-seq（圖1A）。經(jīng)過質(zhì)量控制過濾后，總共保留了來自scRNA-seq的38097個細胞和來自scATAC-seq的21272個細胞用于以下分析?；诮?jīng)典標記基因，在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中鑒定了15種細胞類型（圖1B，1C）。對于scATAC-seq數(shù)據(jù)集，通過Seurat的標簽轉(zhuǎn)移算法和以監(jiān)督方式注釋的細胞簇計算預測分數(shù)（圖1D）。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞類型都存在于兩個數(shù)據(jù)集中，并且在scATAC-seq數(shù)據(jù)集中確定了12種細胞類型（圖1E，1F)。

研究鑒定了5個主要淋巴細胞群：CD4 T細胞（CD4，IL7R，CD3D，CD3E）和CD8 T細胞（CD8A，CD8B，CD3D，CD3E），Treg細胞（FOXP3，IL2RA），自然殺傷細胞（NK）/自然殺傷T細胞（NKT）（KLRD1，GNLY）和B細胞（MS4A1 / CD20，CD79A）。髓系亞群包括巨噬細胞（CSF1R，CD68，CD163），單核細胞（S100A12，F(xiàn)CGR3A / CD16）和肥大細胞（TPSAB1，KIT）。非免疫細胞包括內(nèi)皮細胞（PECAM1，PTPRB），系膜細胞（PDGFRB，ACTA2）以及兩種不同的內(nèi)皮亞群（圖1C，1F）。

接下來，通過識別經(jīng)典腫瘤標記CA9和拷貝數(shù)變異（CNV）來鑒定腫瘤細胞。在ccRCC的腫瘤微環(huán)境（TME）中，免疫細胞是數(shù)量最多，占總細胞的70%以上，而腫瘤細胞占比小于<10%。綜上，研究整合scRNA-seq和scATAC-seq揭示了ccRCC的異質(zhì)性。

圖1 | 人ccRCC的單細胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性分析

2、ccRCC中腫瘤特異性調(diào)節(jié)元件

為了研究所有細胞類型之間染色質(zhì)可及性的差異，首先使用MACS2在scATAC-seq數(shù)據(jù)中確定了212326個峰，其中約10.6%（22682個獨特峰）在細胞類型之間表現(xiàn)出顯著差異，這些位點被定義為差異可及性染色質(zhì)區(qū)域（DARs）（圖2A）。大多數(shù)DARs位于基因組的啟動子和內(nèi)含子區(qū)，并且DARs的分布在細胞類型之間相對保守（圖2B）。此外，腫瘤細胞的DARs顯著富集與代謝相關(guān)的生物學過程（圖2C）。

接下來，研究應用chromVAR在scATAC-seq數(shù)據(jù)中推斷轉(zhuǎn)錄因子（TF）基序的活性。差異TF的分層聚類揭示了細胞類型間共享的和獨特的調(diào)控元件（圖2D）。識別不同的譜系特異性TF進一步支持了細胞類型的鑒定結(jié)果。例如，TF T-BOX（EOMES，TBX5）僅在NK / NKT和CD8 T細胞群中富集；SPI127在巨噬細胞富集；CEBP在單核細胞富集；GATA229在肥大細胞富集。此外，兩中內(nèi)皮亞群在TF的富集上也表現(xiàn)出差異性（圖2D）。

為了揭示腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中關(guān)鍵的TF，研究選擇了49個僅在腫瘤細胞中高度富集的TF（圖2E），如肝細胞核因子1（HNF1A，HNF1B），與腎臟發(fā)育障礙相關(guān)的組織限制性TF，HOX家族TF等。這些腫瘤特異性TF與癌癥基因組圖譜腎透明細胞癌（TCGA-KIRC）隊列中腫瘤患者的預后相關(guān)。腫瘤特異性TF平均表達量高的患者其總生存期比平均表達量低的患者更短（圖2F）。

圖2 | 鑒定人ccRCC腫瘤特異性調(diào)節(jié)元件

為了進一步研究和驗證這些TF在ccRCC中的生物學功能，研究選擇了四種TF（HOXC5，VENTX，ISL1和OTP），其表達水平與TCGA-KIRC數(shù)據(jù)集中較差的總生存率顯著相關(guān)（圖3A）。研究鑒定了這些TF的靶基因，其啟動子或連接的候選順式調(diào)節(jié)元件（cCREs）是可可及性的，并且在腫瘤細胞中含有TF結(jié)合基序。這4種TF調(diào)節(jié)多個腫瘤特異性基因，如FXYD2和CRYAB（圖3B）。重要的是，敲除這些TF能顯著降低腫瘤細胞增殖并增加了細胞死亡（圖3C,3D）。

利用小分子化合物擾動數(shù)據(jù)庫LINCS研究靶向這些TF的潛在藥物，發(fā)現(xiàn)FDA批準的兩種候選藥物（高三尖杉酯堿和米托坦）可以顯著降低HOXC5，ISL1和VENTX的表達水平（圖3E)。經(jīng)驗證，這兩種藥物均能顯著降低腫瘤細胞的增殖以及HOXC5，ISL1和VENTX在腎癌細胞系中的表達水平（圖3F–3J)?？傊?，研究鑒定了腫瘤特異性調(diào)節(jié)元件，并驗證了它們在促進腫瘤生長中的作用。

圖3 | 4種腫瘤特異性TF

3、ccRCC中的惡性轉(zhuǎn)錄程序

為了探索ccRCC內(nèi)不同惡性細胞表達狀態(tài)的差異，該部分研究關(guān)注來自4個樣本的3564個腫瘤細胞。成對相關(guān)性分析揭示了這些腫瘤細胞不同的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)（圖4A）。非負矩陣分解（NMF）進一步探究了腫瘤的異質(zhì)性，研究確定了2個薈萃表達程序，它們在4個樣本間包含高度相似的表達程序（圖4B）。薈萃表達程序1的基因顯著富集缺氧和MAPK信號等應激相關(guān)途徑，而薈萃表達程序1的基因顯著富集代謝相關(guān)生物過程，如糖酵解和單糖代謝（圖4C)。

此外，高表達薈萃表達程序1的患者的總生存期比低表達的患者更短，而高表達薈萃表達程序2的患者有更長的總生存期（圖4D，4E）。在薈萃表達程序1中，4個TF都表現(xiàn)出與VEGFA的作用關(guān)系（圖4F)；在薈萃表達程序2中，CRYAB（腫瘤細胞中第二重要的差異基因）由四個TF共同調(diào)節(jié)（圖4G)?？傊芯吭赾cRCC腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了2個主要的轉(zhuǎn)錄程序，并進一步確定了這2個轉(zhuǎn)錄程序可能調(diào)節(jié)的基因。

圖4?| ccRCC內(nèi)的惡性轉(zhuǎn)錄程序

4、CCRCC中的CD8 T細胞聚類和特征分析

CD8 T淋巴細胞在抑制腫瘤進展方面起重要作用，研究進一步劃分了scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)集中的CD8 T細胞亞群。在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中確定了4個亞群，在scATAC-seq數(shù)據(jù)集中確定了5個亞群（圖5A，5B)。其中組織駐留CD8 T細胞（CD69，ZNF683/Hobit，ITGAE / CD103，ITGA1 / CD49A）包括一個高表達效應分子（TNF，IFNG和GZMA）的細胞簇C2和一個高表達幼稚/記憶基因（IL7R，CCR7和TCF7）的細胞簇C1。IEG CD8 T細胞高表達激活后早期誘導的基因如HSPA1A，DNAJB1，JUNB和ATF3等（圖5D）。

研究使用多個功能基因集進一步研究了CD8 T細胞亞群的功能特性，耗竭型CD8 T細胞的細胞毒性和耗竭的特征評分最高（圖5D，5E）。組織駐留的C1細胞簇具有最高的祖細胞耗竭特征評分和最低的終末細胞耗竭特征評分（圖5F），可能對抗PD1治療的反應更好。對差異表達基因富集分析發(fā)現(xiàn)組織駐留C1細胞簇與炎癥反應顯著相關(guān)，組織駐留C2細胞簇與細胞因子和維生素代謝途徑相關(guān)（圖5G）。此外，與T細胞耗竭有關(guān)的TF EOMES和BATF在耗竭型CD8 T細胞中富集，兩個IEG細胞簇受不同的TF調(diào)節(jié)（圖5h)。

圖5 | ccRCC中的CD8 T細胞

5、CCRCC中的巨噬細胞聚類和特征分析

腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）是腫瘤中髓系的主要細胞類型，研究進行了類似于CD8 T細胞的聚類分析，并鑒定了3個TAM細胞簇（圖6A–6C）。TAM-C1QB細胞簇表達補體基因，APOE，早期反應基因（IER2和JUN）以及MHC II類分子（圖6D)。TAM-RGCC細胞簇表達高水平的RGCC和促炎基因（NLRP353、CLEC5A、IL1A/B）。TAM-LGALS3細胞簇表現(xiàn)為C1QB和C1QC的中間表達，但參與M2巨噬細胞活化的基因（ANXA254和LGALS355）高表達。

不同巨噬細胞亞型表現(xiàn)出功能差異，TAM-RGCC簇表現(xiàn)出最高的M1特征評分，而M2特征主要在TAM-LGALS3細胞簇中富集(圖6E）。TAM-RGCC細胞簇具有較高的血管生成特征評分（圖6F）。值得注意的是，TAM-C1QB細胞簇在scRNA-seq數(shù)據(jù)中顯示出最高的吞噬作用特征評分，表明具有高吞噬活性（圖6G)。然而，scATAC-seq數(shù)據(jù)沒有顯示出類似的趨勢，可能是由于其數(shù)據(jù)的稀疏性。

此外，在TAM-C1QB和TAM-RGCC細胞簇中檢出多個共刺激信號，但在TAM-LGALS3細胞簇中未檢出（圖6H)。四種TF（MEF2C，NFKB1，RUNX3和ENO1）的基因表達和活性均顯著增加（圖6i），MEF2C調(diào)節(jié)多個TF（FOXO1，NEU1和NRP1）和趨化因子（CCL3和CCL3L1）（圖6J），與巨噬細胞的吞噬作用和血管生成有關(guān)。

圖6 | ccRCC中的巨噬細胞

6、ccRCC微環(huán)境中的細胞間通訊

研究應用CellPhoneDB研究了ccRCC微環(huán)境中的細胞間通信，內(nèi)皮細胞具有最多的配體-受體相互作用對，而B細胞最少（圖7a）。研究特別建立了腫瘤細胞的細胞間通訊（圖7B)，腫瘤細胞通過多種配體-受體與內(nèi)皮、TAMs、增殖型CD8 T細胞和耗竭型CD8 T細胞進行通訊交流（圖7C）。接下來，在髓系和淋巴系中選擇了與腫瘤細胞相互作用次數(shù)最多的三個細胞亞群進行進一步研究，巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）及其受體（CD44和CD74）介導的腫瘤細胞與TAM之間的強相互作用，在血管生成和免疫逃逸中起重要作用（圖7D）。RPS19和C5AR1表達高的患者在TCGA-KIRC數(shù)據(jù)集中預后較差（圖7E)。

此外，研究確定了腫瘤細胞和三個淋巴細胞亞群之間的相互作用（圖7F)，發(fā)現(xiàn)LTB和LTBR的高表達與TCGA-KIRC數(shù)據(jù)集中的患者不良預后相關(guān)（圖7G)。

圖7 | 腫瘤和免疫細胞之間基于配體受體的細胞間通訊

文章總結(jié)

本研究應用單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序（scATAC-seq）揭示ccRCC的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組特征。研究確定了由四個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（HOXC5，VENTX，ISL1和OTP）介導的腫瘤特異性調(diào)控程序，這些轉(zhuǎn)錄組因子在癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中具有預后意義。研究綜合分析了CD8 T細胞和巨噬細胞的染色質(zhì)可及性和基因表達特征。此外，研究描述了由腫瘤微環(huán)境中配體-受體相互作用介導的細胞間通訊?？傊?，該研究深入了解了腫瘤異質(zhì)性和潛在的調(diào)節(jié)因素，有利于未來選擇更有效的臨床治療策略。

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