寫在前面

????????今天推薦的是由西雅圖弗雷德·哈金森癌癥研究中心團隊在2017年6月20日發(fā)表于Cell Reports（IF:7.985，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Toshiyasu Taniguchi教授，研究表明泛素化相關(guān)的FANCI磷酸化可完全激活FANCI/D2復合物并使其無需去泛素化即可發(fā)揮作用。

研究背景

????????Fanconi貧血（FA）是一種遺傳性疾病，其特征是骨髓衰竭、易患癌癥以及細胞對DNA鏈間交聯(lián)（ICLs）敏感。FA通路的功能依賴于FA核心復合物催化的FANCD2單泛素化。這種修飾使FANCD2定位于DNA損傷部位并協(xié)調(diào)修復ICLs。另一方面，USP1對FANCD2的去泛素化也是FA通路所必需的。

????????先前的研究表明，ATR介導FANCI上6個位點（S/TQ簇結(jié)構(gòu)域內(nèi)）的磷酸化從而促進FANCI/D2的單泛素化?，F(xiàn)有模型認為FANCI磷酸化是一個上游事件，其發(fā)生在FANCI/D2單泛素化之前。先前的研究很少考慮這種磷酸化是否在FA通路中起其他作用。此外，DNA損傷后具體哪一個FANCI的S/TQ簇位點被磷酸化還知之甚少。

摘要部分

????????本研究中，作者制備了針對hFANCI上三個不同S/TQ簇位點（S556、S559和S565）的磷酸化特異性抗體。作者發(fā)現(xiàn)，某些FANCI位點（S559和S565）的磷酸化與FANCI的單泛素化有關(guān)，這與現(xiàn)有模型不同。本研究認為泛素化相關(guān)的FANCI磷酸化作用于FANCI/D2單泛素化的下游，可在不破壞FA通路功能的情況下維持FANCD2的單泛素化。此外，USP1的缺失雖然增加了FANCI/D2的單泛素化水平，但抑制了泛素化相關(guān)的FANCI磷酸化。

研究內(nèi)容

1.抗hFANCI上S/TQ簇位點的磷酸化特異性抗體的鑒定? ? ?

????????作者通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)hFANCI中S/TQ簇的兩個位點S556和S565在本實驗條件下被磷酸化。因此作者制備了特異性檢測這兩個位點磷酸化的抗體，還生產(chǎn)了一種針對S559磷酸化的特異性抗體。

????????這些抗體可用于檢測U2OS細胞中三個FANCI磷酸化位點中的每一個在MMC刺激下的ATR依賴性磷酸化。作者證實了在S556、S559或S565磷酸化的破壞性突變導致相關(guān)信號丟失，表明每個磷酸化抗體都具有位點特異性。

研究結(jié)論：hFANCI的S/TQ簇中至少有三個位點以ATR依賴的方式響應(yīng)ICLs而被磷酸化。

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2.?FANCI磷酸化與FANCI/D2單泛素化在細胞周期進程中共同調(diào)控

????????接下來，作者分析了在雙胸苷或諾可達唑處理后，U2OS細胞在不同時間點的FANCI磷酸化。與FANCI磷酸化調(diào)控FANCD2單泛素化的報道一致，當已知FANCD2單泛素化發(fā)生時，所有三個位點在S期均發(fā)生磷酸化。

????????在細胞分級分離實驗中，作者發(fā)現(xiàn)MMC處理的U2OS細胞沉淀（含染色質(zhì)）中S556、S559和S565的磷酸化顯著增加。這表明大多數(shù)FANCI磷酸化發(fā)生在與染色質(zhì)結(jié)合的FANCI上。

研究結(jié)論：FANCI磷酸化不僅在外源DNA損傷反應(yīng)中起作用，而且在正常的細胞周期進程中也起作用。

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3.FANCI中S/TQ簇的泛素化非依賴性和泛素化相關(guān)的磷酸化??? ?

????????作者之前觀察到S556磷酸化主要在非泛素化的FANCI上檢測到，相比之下，S559和S565磷酸化主要在單泛素化的FANCI上檢測到。作者還觀察到原代人類包皮成纖維細胞中S556和S565的磷酸化差異。? ? ?

????????進一步研究發(fā)現(xiàn)，MMC誘導非泛素化FANCI的S556磷酸化可在缺乏FA核心復合物時發(fā)生。然而，非泛素化FANCI上S559/S565的磷酸化部分或完全受損。一系列的研究表明，只有當FANCI和FANCD2是單泛素化狀態(tài)時，F(xiàn)ANCI在S559/S565才能發(fā)生最佳磷酸化。

????????實驗顯示，MMC處理后，所有三個位點都對FANCD2的單泛素化起正調(diào)控作用。每個位點磷酸化的破壞性突變抑制了FANCD2單泛素化，而類磷酸化突變增加了FANCD2單泛素化。

研究結(jié)論：FANCI中S/TQ簇的非泛素化依賴（S556）和泛素化相關(guān)的（S559/S565）磷酸化位點對FANCD2單泛素化起正向調(diào)控作用。

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4.USP1是泛素化相關(guān)的FANCI磷酸化所必需的

????????實驗顯示，即使沒有MMC處理，USP1的缺失也會導致U2OS細胞中FANCI和FANCD2的單泛素化增加。然而，未處理情況下積累的單泛素化FANCI在相關(guān)位點沒有發(fā)生磷酸化。此外，與對照細胞相比，在MMC處理后USP1缺失細胞中泛素相關(guān)的FANCI磷酸化減少了。研究表明，USP1的去泛素活性是這些位點的磷酸化所必需的。

研究結(jié)論：抑制USP1增加了FANCI/D2的單泛素化，這與泛素化相關(guān)的FANCI磷酸化被抑制有關(guān)。

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5.泛素化相關(guān)的FANCI擬磷酸化使FA通路無需FANCD2的去泛素化便能發(fā)揮功能? ? ?

????????研究表明S559/S565磷酸化在抑制FANCD2的去泛素化中起作用。作者發(fā)現(xiàn)，在U2OS細胞中加入ATR抑制劑時，F(xiàn)ANCI和FANCD2都迅速去泛素化，這種去泛素化與S559和S565的逐漸去磷酸化有關(guān)。? ? ?

????????實驗顯示，S559D-S565D FANCI對FANCD2單泛素化的影響與USP1敲低或被抑制相似。此外，S559D-S565D FANCI在停用MMC到加入ATR抑制劑后強烈延緩了FANCD2的去泛素化。? ? ?

????????研究表明，在USP1缺乏或被抑制時，F(xiàn)ANCD2去泛素化受抑制是FA通路功能不良的原因。此外，不能被去泛素化的FANCD2-泛素融合蛋白修復ICL的能力受損。

????????與先前的研究一致，USP1抑制劑（ML323）的處理使細胞對MMC敏感。另外，作者觀察到的USP1被抑制時ICL修復的受阻可能是另一種機制的影響。

研究結(jié)論：泛素化相關(guān)的FANCI位點的持續(xù)磷酸化能夠避開FANCD2的去泛素化使FA通路發(fā)揮功能，并緩和USP1被抑制時細胞對MMC的敏感性。

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結(jié)論與討論

????????研究表明，激活的FANCI/D2復合物不僅是單泛素化的，還有以泛素化相關(guān)的方式磷酸化的。作者的工作構(gòu)建了一個關(guān)于FANCI磷酸化如何激活FANCI/D2復合物的精細模型。泛素化相關(guān)的FANCl磷酸化導致FANCD2單泛素化的增加，這在功能上以及疾病治療方面具有一定意義。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.05.081