外顯子測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法。是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略,外顯子測序相對于基因組重測序成本較低,對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢。外顯子組測序主要用于識別和研究與疾病、種群進(jìn)化相關(guān)的編碼區(qū)及UTR區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異。結(jié)合大量的公共數(shù)據(jù)庫提供的外顯子數(shù)據(jù),有利于更好地解釋所得變異結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)和致病機(jī)理。

? 基因組DNA提取:根據(jù)不同的樣品類型采用不同的提取方案,獲得高質(zhì)量的基因組DNA。

? DNA質(zhì)量檢測:Nanodrop檢測DNA樣品濃度及純度;瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品完整性。

? DNA片段化:采用超聲波打斷的方法,將DNA片段化至150-200bp。

? 捕獲前DNA文庫構(gòu)建:構(gòu)建外顯子捕獲前DNA文庫,引入接頭序列及index序列。

? 捕獲前DNA文庫質(zhì)檢:Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小分布,Qubit 3.0測定文庫濃度。

? 外顯子捕獲:采用Agilent全外顯子捕獲試劑盒(v6+cosmic)。

? 捕獲后PCR富集:PCR富集捕獲后外顯子文庫片段。

? 外顯子文庫質(zhì)檢:Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小分布,Qubit 3.0或熒光定量PCR測定文庫濃度。

? 上機(jī)測序:根據(jù)數(shù)據(jù)量要求將文庫pooling上機(jī)測序。

? 數(shù)據(jù)分析:下機(jī)數(shù)據(jù)由專業(yè)生物信息分析團(tuán)隊進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,提供全面數(shù)據(jù)分析報告。

樣品要求

? 樣品類型:細(xì)胞、新鮮組織或DNA樣品。

? 樣品量:細(xì)胞樣品請?zhí)峁┲辽?×106個細(xì)胞,組織樣品請?zhí)峁┲辽?00mg的組織塊或切片,DNA樣品請?zhí)峁?μg以上的總DNA。

? 樣品質(zhì)量:DNA無明顯降解,無蛋白污染,OD260/280值 ≥ 1.5,OD260/230值 ≥ 1.0,濃度 ≥ 50 ng/μL。

? 樣品保存:

細(xì)胞樣品:收集細(xì)胞至RNase Free 1.5mL EP管,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗一次,棄去PBS,把細(xì)胞沉淀保存在-80℃。

組織樣品:組織樣品離體后放在凍存管中,迅速置于液氮下速凍1分鐘以上,然后保存在-80℃。

DNA樣品:可將DNA溶于Nuclease Free 的超純水中,-20℃保存。

樣品保存期間避免反復(fù)凍融。

? 樣品運輸:樣品置于1.5 mL管中,封口膜封好,冷凍運輸。

測序方案

測序模式 PE150

測序數(shù)據(jù)量 9Gb clean data

生物信息分析內(nèi)容

基礎(chǔ)分析

1 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控檢查

2 比對結(jié)果質(zhì)控檢查

3 外顯子覆蓋率統(tǒng)計及制圖

4 germline SNP及InDel 檢測、注釋及統(tǒng)計

5 somatic SNP及InDel、CNV檢測、注釋及統(tǒng)計(成對樣品)

高級分析

6 稀有突變及疾病相關(guān)突變篩選

7 高頻突變基因篩選

8 高頻突變基因GO及通路分析

9 組間差異突變位點/基因比較