近年來隨著組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，其成本越來越低，成為科研工作者發(fā)文章的利器。

但是目前單一組學(xué)的文章很多，分析思路也大體相同。

在這種環(huán)境下想突破重圍發(fā)高分文章還是比較困難的。因此有些科研工作者就開始著手涉及多組學(xué)聯(lián)合分析。

但是多組學(xué)聯(lián)合分析實驗該如何設(shè)計？

討論點該怎么選這些都是難題。今

天就跟大家分享一篇植物脅迫下轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合代謝組分析的文章，為大家的實驗設(shè)計提供點新的思路。

這篇文章的題目是Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses，文章發(fā)表在Plant cell and environment上，這是一個一區(qū)7.228分的期刊。

下面我們來詳細(xì)看看文章的主要內(nèi)容吧。

在植物根部真菌病原體病理系統(tǒng)中，根部感染前后的轉(zhuǎn)錄重編程以及植物根部與根部感染病原體之間信號交換過程的性質(zhì)的研究還比較少。本研究研究了受到Fg（禾谷鐮刀菌）感染后Bd（禾本科模式植物短柄草）根中的轉(zhuǎn)錄合代謝變化。

1. 材料與方法

1.1? 植物、真菌和細(xì)菌的生產(chǎn)條件（植物：B. distachyon (Bd) 栽培品種 Bd21-3；真菌：禾谷鐮刀菌 (Fg) 分離株野生型 CS3005 和 Tri5 突變體（DON缺陷菌株）；細(xì)菌：Escherichia coli Top10 和 Agrobacterium tumefaciens AGL-1 菌株）

1.2? 植物轉(zhuǎn)基因（過程很詳細(xì)，值得寫作參考）

1.3 短柄草根部感染實驗

1.4 RNA提取與qRT-PCR分析

1.5 RNA-seq和根部轉(zhuǎn)錄組分析

1.6 差異表達(dá)基因的功能注釋

1.7 序列對比與拼接

1.8 根系分泌物提取和非靶向代謝分析

1.9 SWATH 數(shù)據(jù)采集與分析

1.10??? 根染色和組織學(xué)

2. 結(jié)果

2.1 短柄草根對禾谷鐮刀菌(Fg)WT（CS3005）和DON缺陷菌株（Tri5突變體）的感染反應(yīng)不同

為了研究Bd根在防御根病原體中的潛在作用，評估了Fg感染后Bd根的轉(zhuǎn)錄變化。總共檢測到25,376個轉(zhuǎn)錄本。受感染（Bd+FgWT或Bd+Tri5）和模擬根樣本的成對比較揭示了一系列差異表達(dá)的Bd基因(DEG)。比較真菌誘導(dǎo)的DEG（通過FgWT或Tri5）組中過多的GO術(shù)語表明差異在于細(xì)胞分解代謝和蛋白質(zhì)修飾過程以及羧酸和有機酸轉(zhuǎn)運（圖1B）。雖然FgWT特異性下調(diào)過程主要與高爾基囊泡介導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運有關(guān)，但脂質(zhì)生物合成過程、有機物生物合成和轉(zhuǎn)運、肽轉(zhuǎn)運和植物細(xì)胞壁生物發(fā)生、基因表達(dá)、核糖體生物發(fā)生、翻譯過程僅受根的影響TRI5突變體的感染（圖1B和補充數(shù)據(jù)3）。FgWT和Tri5感染后不同的Bd根轉(zhuǎn)錄反應(yīng)表明DON有助于在Fg感染期間引發(fā)宿主反應(yīng)。

2.2 地下和地上短柄草轉(zhuǎn)錄組包含F(xiàn)g感染后共享的差異調(diào)節(jié)基因

將當(dāng)前根組織轉(zhuǎn)錄組中的DEG與先前報道的Bd地上組織中的DEG 進行了比較。在不同的比較中可以清楚地區(qū)分共享的DEG（圖S4）。但Bd根中兩種真菌菌株觸發(fā)的比例相似（圖S4）。然后，專注于那些在Bd根和被FgWT或Tri5感染的穗中上調(diào)的基因?？偣灿?41個基因?qū)儆谶@一類，其中68個基因與催化活性相關(guān)，21個與氧化還原酶活性相關(guān)，18個基因與轉(zhuǎn)運蛋白活性相關(guān)（補充數(shù)據(jù) 5）。此此外，我們發(fā)現(xiàn)了一組與水楊酸(SA)依賴性防御相關(guān)的DEG。這些基因的調(diào)控意味著SA信號可能是Bd地下和地上組織的重要組成部分。

2.3 與根防御相關(guān)的差異調(diào)節(jié)的Bd轉(zhuǎn)錄因子

當(dāng)Bd根受到FgWT攻擊時，總共有190個推定的TF基因在轉(zhuǎn)錄中被顯著誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)的TFs中，最豐富的組屬于WRKY、MYB和ERF家族。為了驗證單個TF在針對Fg的根防御中的功能，專注于MYB候選者。構(gòu)建了包括所有136個Bd MYB蛋白和來自小麥的所有570個MYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2A和補充數(shù)據(jù)7）。選擇了8種小麥MYB TF進行進一步分析，因為它們先前被鑒定為賦予多種小麥病原體抗病性的介質(zhì)。這些小麥MYB僅與誘導(dǎo)的Bd MYB聚集在一起（圖2A），可能反映了來自兩種谷物的這些TF的保守防御相關(guān)功能。

接下來選擇了最高誘導(dǎo)的MYB TF基因BdMYB78作為驗證Bd根感染轉(zhuǎn)錄組的候選者。在三個獨立的BdMYB78過表達(dá)（OE）Bd根（圖2B和S5）中，與WT和空載體（Ev）轉(zhuǎn)化的根對照相比，在感染7天后觀察到FgWT 感染后根壞死顯著減少（圖2C-D,S5)。在感染7天后，在 BdMYB78-OE根中檢測到的通過相對mRNA 水平量化的Fg定植比在WT Bd中檢測到的更少（圖2D）。

在測試的其他防御標(biāo)記基因中，包括受TaRIM1正調(diào)控的小麥同源物，PR10和編碼幾丁質(zhì)酶的Bradi3g26810在BdMYB78-OE根中被顯著誘導(dǎo)（圖2E），表明BdMYB78在基礎(chǔ)防御中的特定調(diào)節(jié)功能。其他上調(diào)的TF基因也可能參與Bd根和Fg之間的戰(zhàn)斗。

2.4 Fg在接觸前階段在Bd根中引發(fā)的轉(zhuǎn)錄變化

為了了解Bd根是否也能在物理接觸之前感知真菌病原體的存在，進一步探索了先前報道的Bd根在與Fg物理相互作用之前的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。在宿主方面，在與Fg物理接觸之前，總共發(fā)現(xiàn)了357個Bd基因受到不同的調(diào)節(jié)（圖3A）。為了揭示由暴露于Fg的Bd根中鑒定的這些DEG 編碼的蛋白質(zhì)之間的功能聯(lián)系，生成了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。相互作用蛋白質(zhì)的主要簇主要包括編碼屬于轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)錄因子、受體激酶、核糖體生物發(fā)生和細(xì)胞色素P450單加氧酶家族的蛋白質(zhì)的上調(diào)基因（圖3B）。

在Bd根中鑒定的Bd DEG的成對比較（預(yù)接觸和感染）和沒有Fg顯示在物理相互作用開始之前已經(jīng)開始的183個（圖3C）和54個（圖3D）基因的差異調(diào)節(jié)。在183個基因中，預(yù)測有47個具有轉(zhuǎn)移酶和單加氧酶活性的分子功能（圖3C）。15（圖3E）和13（圖3F）個基因在接觸前和感染條件下表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。54（圖3D）和38個（圖3H）基因分別在接觸前階段專門上調(diào)和下調(diào)。在 54個基因中（圖3D），有幾個基因與植物激素相關(guān)，表明根激素過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生了改變。

2.5 Fg在物理接觸之前改變了Bd根的ROS狀態(tài)和發(fā)育

為了確定在接觸前階段是否在根中產(chǎn)生ROS，使用了兩種染色方法，即NBT和HPF染色。如圖4A所示，雖然HPF染色激發(fā)的熒光信號分布在與Fg相鄰的根的檢查區(qū)域，但與在無病原體條件下生長的根相比，預(yù)接觸根在頂端分生組織中的熒光降低，反映hROS積累減少。在受感染的根中，由于防御性ROS和hROS的高度積累，HPF染色會產(chǎn)生非常強的信號。因此，hROS的積累似乎在接觸前階段被病原體抑制。相比之下，NBT嚴(yán)重染色Fg感染的根，而預(yù)接觸和對照根的染色程度相似（圖4B），表明在預(yù)接觸期間根中超氧自由基的產(chǎn)生沒有顯著變化階段。

還發(fā)現(xiàn)在接觸前根部分有更多分裂的中心后生部導(dǎo)管（圖4C-D），這是在較老的部分經(jīng)常觀察到的特征。在預(yù)接觸階段發(fā)現(xiàn)了許多與ROS自由基和細(xì)胞伸長相關(guān)的下調(diào)基因（圖4E）?？傊诟兄≡w的存在時，根經(jīng)歷了一系列與細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的生理和轉(zhuǎn)錄變化。

非靶向代謝組揭示了Bd根中Fg感應(yīng)相關(guān)通路的變化

為了進一步表征根對Fg的反應(yīng)，從處理和對照根中提取根分泌物和接觸前代謝物，并使用非靶向代謝組學(xué)方法進行分析。使用預(yù)測化合物的主成分分析(PCA)評估代謝組學(xué)數(shù)據(jù)。兩個主要成分解釋了39.9%和18.4%的變化（圖5A），表明不同處理中代謝物的總體變化。與Fg預(yù)接觸的根中的代謝物強烈減少（圖5B）。進一步研究中，F(xiàn)g突變體ΔFgANK1被設(shè)定為對照，該突變體被證明缺乏宿主感知，因此不太可能在根和Fg之間的雙向通信系統(tǒng)中發(fā)揮作用。不同真菌菌株的存在顯著影響代謝物豐度，主要由ΔFgANK1誘導(dǎo)的代謝物多于FgWT（圖5B-D）。因為ΔFgANK1在宿主感知中受到損害并且不能“隱藏”。

實際上，ΔFgANK1處理中356種預(yù)測的宿主化合物的豐度高于FgWT，其中101種與僅Bd的樣品相比也被顯著誘導(dǎo)（圖6A，補充數(shù)據(jù)14）。代謝組學(xué)途徑分析表明，這些代謝物主要參與了幾種重要的植物次生代謝途徑（圖6B，補充數(shù)據(jù)14）。其中最豐富的類別包括幾種具有生物活性和防御相關(guān)的類別（圖6A，補充數(shù)據(jù)15）。相比之下，ΔFgANK1和WT處理的比較之間減少的代謝物限制在78種，其中35種受到與ΔFgANK1預(yù)接觸的Bd根的影響，而不是僅Bd的影響（補充數(shù)據(jù)16）。在將預(yù)接觸條件與兩種Fg菌株進行比較時，僅發(fā)現(xiàn)4種化學(xué)類別（酮類、糖苷類、色酮和氨基酸及其衍生物）以及硫代葡萄糖苷活化和N-化合物降解途徑的富集（圖6A-B）。

3. 討論

3.1 復(fù)雜的相互作用強烈影響根的生長和發(fā)育以及植物免疫

3.2 DON在不同的谷物組織中可能具有相似的調(diào)節(jié)功能

3.3 相似的宿主防御機制是否在不同宿主組織中針對Fg起作用

3.4 植物細(xì)胞和代謝對病原體攻擊的反應(yīng)與由TF控制的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄重編程有關(guān)

3.5 Bd根可能被接近的真菌引發(fā)，并引發(fā)了根發(fā)育的變化

3.6 當(dāng)Bd根與Fg預(yù)接觸時，根分泌物的代謝組成發(fā)生了顯著變化

4. 總結(jié)

以上就是文章的介紹，這篇文章在寫作方面值得借鑒。關(guān)于材料方法寫的比較詳細(xì)，實驗設(shè)計也很完善。此外討論點的選擇能帶給我們很多啟發(fā)。想仔細(xì)學(xué)習(xí)一下文章的同學(xué)掃碼獲取原文。