Hisat2和STAR是目前轉(zhuǎn)錄組分析過程中用來做比對的兩款主要工具，記得有一篇好像是2017年的文章專門比較了幾款轉(zhuǎn)錄組比對工具對結(jié)果的影響，結(jié)論中認為兩款軟件在實際使用過程中對結(jié)果影響及耗時區(qū)別不大，我認為選一款就可以，之前總是用STAR,今天試一下Hisat2。

一、官網(wǎng)下載軟件及安裝：

https://daehwankimlab.github.io/hisat2/

在Download頁面，可以看到Hisat2非常友好地提供了二進制的程序及Index(比對時的索引文件)，省去了后續(xù)的一些小麻煩。

下載完后unzip進行解壓，一開始報錯：

原來依賴的libstdc++.so.6需要高版本的庫，我沒有root權(quán)限，更新的話會很麻煩，果斷降版本，下載的hisat2-2.1.0后，解壓，嘗試了一下，安裝成功：

二、構(gòu)建索引Index

Hisat2和STAR在比對時都需要索引文件，對于人及小鼠及常用模式生物，Hisat2官網(wǎng)提供了相應(yīng)的索引文件，下載后就能用，對于非模式生物，需要自己建立索引文件。

區(qū)別于bowtie2的索引只有基因組序列信息，Hisat2建立索引時，應(yīng)該把轉(zhuǎn)錄組信息加進去，此外，Hisat2還支持將SNP信息加入到索引中，這樣比對的時候就可以考慮SNP的情況,需要通過下面命令將SNP文件轉(zhuǎn)換成hisat2-build能使用的文件：

extract_snps.py snp142Common.txt >genome.snp

因為我研究的物種還沒有集合SNP信息的文件，我只能建立涵蓋基因組+轉(zhuǎn)錄組的索引:

Hisat2提供兩個Python腳本將GTF文件轉(zhuǎn)換成hisat2-build能使用的文件,依次運行下面三個命令：

extract_exons.py *.gtf > genome.exon

extract_splice_sites.py *.gtf > genome.ss

hisat2-build genome.fa -p 10 --ss genome.ss--exon genome.exon /path/to/genome_snp_tran

最終生成的8個*.ht是我們比對時需要的索引文件：

三、Hisat2比對：

-x? 指定索引文件所在路徑及前綴

-p? 線程數(shù)

hisat2輸出文件為sam格式，sam文件格式比較大，通常會直接通過“|”傳輸給samtools轉(zhuǎn)為bam文件，并對bam文件進行sort排序，以便后面處理(此步驟通過生信技能樹-健明老師帖子進行改進，在此致謝)。

四、結(jié)果

?????? 結(jié)果會生成bam文件，為二進制格式，無法直接查看，可以導(dǎo)入IGV進行可視化，一般后面結(jié)果沒有異常時，我不會去用IGV去看看比對結(jié)果去。而比對過程中的日志結(jié)果需要我們記錄一下:

我的總體比對率是73.19%，是比較低的，人的話得90%以上才認為是比較好，我的是非模式生物，目前也只能先接受這個結(jié)果了，后面得想辦法再優(yōu)化。

參考

Kim, D., Paggi,J.M., Park, C.?et al.?Graph-based genome alignment andgenotyping with HISAT2 and HISAT-genotype.?Nat Biotechnol?37,907–915 (2019).?https://doi.org/10.1038/s41587-019-0201-4

http://www.360doc.com/content/21/0714/12/76149697_986501798.shtml

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