寫在前面

????????今天推薦的是由武漢大學(xué)高等研究院生命科學(xué)學(xué)院在2020年8月19日發(fā)表于Nature（2020IF：49.962，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Bao-Liang Song教授，研究表明進(jìn)食后，USP20可以通過mTORC1-USP20-HMGCR軸誘導(dǎo)膽固醇生物合成。

研究背景

????????膽固醇是一種必需的脂質(zhì)。在哺乳動(dòng)物中，膽固醇生物合成在進(jìn)食后增加，并在禁食情況下被抑制。然而，對空腹-進(jìn)食過渡階段膽固醇生物合成的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。

摘要部分

????????在這里，作者展示了去泛素化酶泛素特異性肽酶20(USP20)在進(jìn)食狀態(tài)下穩(wěn)定HMG-CoA還原酶(HMGCR)。餐后胰島素和葡萄糖濃度的增加刺激mTORC1在S132和S134磷酸化USP20；USP20被募集到HMGCR復(fù)合物并對抗其降解。在肝臟特異性Usp20缺失小鼠和USP20 (S132A/S134A)敲入小鼠中，喂養(yǎng)誘導(dǎo)的HMGCR穩(wěn)定性被消除。USP20的基因缺失或藥理學(xué)抑制顯著降低飲食誘導(dǎo)的體重增加，降低血清和肝臟中的脂質(zhì)水平，提高胰島素敏感性并增加能量消耗。這些代謝變化被組成性穩(wěn)定的HMGCR(K248R)的表達(dá)逆轉(zhuǎn)。該研究揭示了通過USP20磷酸化從mTORC1到HMGCR的調(diào)節(jié)軸，并表明USP20抑制劑可用于降低膽固醇水平以治療代謝疾病，包括高脂血癥、肝脂肪變性、肥胖癥和糖尿病。

研究內(nèi)容

1.進(jìn)食誘導(dǎo)HMGCR表達(dá)? ? ? ?

????????為了研究禁食和喂養(yǎng)條件下膽固醇生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，作者測量了肝臟中膽固醇生成酶的表達(dá)，包括HMGCR、FDFT1、羊毛甾醇合酶(LSS)和24-脫氫膽固醇還原酶(DHCR24)。禁食過夜后，小鼠被喂食高蔗糖、低脂肪、低膽固醇的飲食，以消除反饋調(diào)節(jié)的干擾。重新喂食后，HMGCR蛋白的水平增加了約20倍，而FDFT1、LSS和DHCR24的水平增加了不到1倍。編碼這些蛋白質(zhì)的mRNA增加了兩到四倍。這些結(jié)果表明，喂食后HMGCR蛋白的誘導(dǎo)除了充分表征的轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，還涉及轉(zhuǎn)錄后機(jī)制。當(dāng)甾醇水平高時(shí)，HMGCR被E3連接酶gp78泛素化并靶向降解。

????????當(dāng)甾醇水平高時(shí)，HMGCR被E3連接酶gp78泛素化并靶向降解。作者使用體外泛素化系統(tǒng)評(píng)估了這種機(jī)制是否針對HMGCR降解饑餓和重新喂養(yǎng)的小鼠。作者觀察到禁食小鼠肝細(xì)胞質(zhì)中的HMGCR泛素化程度高于禁食小鼠。為了探究禁食肝細(xì)胞質(zhì)中是否含有更高的去泛素化酶(DUB)活性。作者接下來進(jìn)行了體外去泛素化分析。作者從用25-HC和MG132處理的CHO-7細(xì)胞中免疫沉淀泛素化HMGCR，然后將免疫沉淀物與來自肝臟的胞質(zhì)溶膠一起孵育。HMGCR泛素化在禁食肝細(xì)胞溶膠存在下沒有改變，但被再禁食肝細(xì)胞溶膠顯著降低?？傊@些結(jié)果表明，喂養(yǎng)小鼠的肝臟含有更高的DUB活性，這可以保護(hù)HMGCR免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。

研究結(jié)論：USP20是喂食誘導(dǎo)的HMGCR增加所必需的。

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2.進(jìn)食誘導(dǎo)的HMGCR需要USP20? ? ?

????????作者在篩選HMGCR降解阻滯劑的篩選中將單個(gè)DUB與HMGCR和INSIG119共表達(dá)，從中篩選出USP20。與WT USP20相比，酶促失活的USP20（C154S）不能穩(wěn)定HMGCR。USP20優(yōu)先水解K48-和K63-鍵并減少HMGCR泛素化，這被USP20特異性抑制劑GSK2643943A抑制。相反，USP20的敲低加速了HMGCR的降解。

????????USP20在肝臟中高度表達(dá)，表明其在肝功能中具有潛在作用。作者生成了肝臟特異性Usp20缺陷小鼠（L-Usp20-/-）。重新喂養(yǎng)顯著增加了野生型中的HMGCR蛋白水平，但在L-Usp20-/-肝臟中沒有。響應(yīng)禁食-再進(jìn)食轉(zhuǎn)變的磷酸化AKT（p-AKT）、p-S6K、p-4E-BP1、p-ACACA、INSIG2和脂肪酸合酶（FASN）的水平在兩種基因型中相似。作者接下來通過分析3H標(biāo)記的H2O的摻入來測量從頭膽固醇生物合成。重新喂養(yǎng)使野生型肝臟中的膽固醇合成增加了12.4倍，但這種影響在L-Usp20-/-肝臟中降低了45%。這些結(jié)果表明USP20是進(jìn)食反應(yīng)性肝臟HMGCR去泛素化酶，其消融不影響胰島素和葡萄糖信號(hào)通路。

研究結(jié)論：進(jìn)食誘導(dǎo)的HMGCR需要USP20參與。

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3.胰島素和葡萄糖調(diào)節(jié)USP20功能

????????作者接下來試圖確定介導(dǎo)USP20穩(wěn)定HMGCR的喂養(yǎng)信號(hào)。由于喂食后最顯著的變化發(fā)生在循環(huán)葡萄糖和胰島素中，作者將野生型小鼠禁食過夜并腹腔內(nèi)注射葡萄糖或胰島素。肝臟HMGCR表達(dá)被葡萄糖和胰島素協(xié)同升高，而USP20水平保持不變。胰島素和葡萄糖在野生型中顯著增加了HMGCR蛋白水平，但在Usp20缺陷型肝細(xì)胞中沒有增加。胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)涉及PI3K、AKT和mTOR23，而AMPK在低葡萄糖時(shí)抑制mTORC1活性。PI3K抑制劑、AKTi-1/2（一種AKT抑制劑）和雷帕霉素（一種mTORC1抑制劑）都消除了USP20介導(dǎo)的HMGCR積累。相反，AMPK抑制劑dorsomorphin在低葡萄糖條件下通過USP20恢復(fù)了HMGCR穩(wěn)定性，而AMPK激活劑A-769662在高葡萄糖條件下抑制了USP20介導(dǎo)的HMGCR穩(wěn)定性。因此，USP20可能對mTORC1下游的胰島素和葡萄糖有反應(yīng)。

研究結(jié)論：胰島素和葡萄糖調(diào)節(jié)USP20功能。

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4.mTORC1在S132和S134位點(diǎn)磷酸化USP20

????????定量質(zhì)譜鑒定了USP20的幾種差異磷酸化肽。Ser132和Ser134殘基的磷酸化僅在高葡萄糖條件下檢測到。作者使用了對USP20 (p-USP20)的磷酸化Ser132和Ser134特異的抗體，并表明USP20在體外被免疫沉淀的mTORC1有效特異性磷酸化。而USP20 (S132A/S134A)未被mTORC1磷酸化。雷帕霉素抑制細(xì)胞和重新喂養(yǎng)小鼠肝臟中USP20的磷酸化并抵消喂養(yǎng)誘導(dǎo)的HMGCR和血清脂質(zhì)水平的增加。無磷酸化的USP20 (S132A/134A)和擬磷酸化的USP20 (S132D/S134D)在體外表現(xiàn)出與野生型USP20相似的DUB活性。然而，與野生型USP20和USP20（S132D/S134D）不同，USP20（S132A/134A）不拮抗甾醇誘導(dǎo)的HMGCR降解。HMGCR與野生型USP20和USP20（S132D/S134D）相互作用，但不與USP20（S132A/S134A）相互作用。這種相互作用在缺乏Gp78（也稱為Amfr）的細(xì)胞中完全不存在，這表明gp78可能橋接USP20和HMGCR之間的相互作用。事實(shí)上，gp78與USP20相互作用，而不管甾醇水平如何，并且包括殘基383-578在內(nèi)的gp78區(qū)域是USP20結(jié)合所必需的。此外，磷酸酶處理大大減少了USP20和USP20-gp78相互作用的磷酸化。接下來，作者生成了USP20（S132A/S134A）敲入（Usp20KI/KI）小鼠。重新進(jìn)食后，野生型小鼠的肝臟HMGCR水平顯著增加，但Usp20KI/KI小鼠的肝臟HMGCR水平僅略有增加。USP20在S132/S134處的喂養(yǎng)誘導(dǎo)的磷酸化在Usp20KI/KI小鼠中也被消除。Usp20KI/KI小鼠的脂質(zhì)水平低于野生型小鼠，肝臟基因表達(dá)譜與L-Usp20-/-小鼠相似。與來自重新喂養(yǎng)的野生型小鼠的肝細(xì)胞質(zhì)不同，來自L-Usp20-/-、Usp20KI/KI或雷帕霉素處理的野生型小鼠的肝細(xì)胞質(zhì)不會(huì)導(dǎo)致HMGCR泛素鏈的裂解。喂養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素和葡萄糖信號(hào)通路激活mTORC1，其在S132和S134處磷酸化USP20。然后磷酸化的USP20結(jié)合gp78并通過去泛素化穩(wěn)定HMGCR，從而增加肝臟中膽固醇的生物合成。

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研究結(jié)論：mTORC1在S132和S134位點(diǎn)磷酸USP20。

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5.L-Usp20-/-小鼠的代謝特征

????????為了進(jìn)一步研究USP20在代謝疾病中的功能，作者用高脂肪和高蔗糖(HFHS)飲食喂養(yǎng)小鼠。與WT小鼠相比，L-Usp20-/-小鼠表現(xiàn)出相似的累積食物攝入量和營養(yǎng)吸收，但體重增加較少。L-Usp20-/-小鼠表現(xiàn)出相似的瘦體重與體重比，但肝臟和白色脂肪組織(WAT)中的脂肪積累較少，并且所有脂蛋白組分中的膽固醇和甘油三酯水平較低。此外，L-Usp20-/-小鼠的葡萄糖清除率和胰島素敏感性得到顯著改善。Usp20KI/KI小鼠表現(xiàn)出類似的趨勢。HFHS喂養(yǎng)三周后，在體重出現(xiàn)差異之前，L-Usp20-/-小鼠的耗氧量和能量消耗顯著增加，但呼吸交換比和體力活動(dòng)沒有差異。事實(shí)上，L-Usp20-/-小鼠表現(xiàn)出比野生型小鼠更高的體溫；這種增加的能量消耗為這些小鼠在維持HFHS飲食時(shí)體重增加較低和其他代謝差異提供了解釋。長期HFHS飲食的小鼠會(huì)患上代謝性疾病。與食物飲食相比，慢性HFHS飲食增加了野生型和L-Usp20-/-小鼠的AKT-mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)并降低了AMPK活性。USP20在S132和S134處的磷酸化顯著增加，HMGCR水平在野生型小鼠中升高。盡管飼料喂養(yǎng)和HFHS喂養(yǎng)的野生型小鼠對禁食-再喂養(yǎng)模式仍然有反應(yīng)，但在HFHS喂養(yǎng)組中，再喂養(yǎng)誘導(dǎo)了更高的mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)和更高的HMGCR水平。這些結(jié)果表明，長期HFHS飲食會(huì)長期激活mTORC1，通過磷酸化USP20和加劇代謝疾病來增加HMGCR水平。

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????????為了研究HMGCR的不穩(wěn)定是否對L-Usp20-/-小鼠的表型至關(guān)重要，作者使用腺相關(guān)病毒血清型8(AAV8)來表達(dá)HMGCR(K248R)，這是一種對甾醇誘導(dǎo)的降解或USP20介導(dǎo)的穩(wěn)定具有抗性的HMGCR突變體，在小鼠肝臟中。AAV-HMGCR(K248R)表達(dá)消除了L-Usp20-/-小鼠體重、血清總膽固醇和甘油三酯的改善。L-Usp20-/-小鼠能量消耗和葡萄糖清除的增加也被HMGCR(K248R)的表達(dá)逆轉(zhuǎn)。作者接下來生成了HMGCR(K248R)敲入小鼠(HmgcrKI/KI)并將它們與L-Usp20-/-雜交。與野生型HMGCR相比，HMGCR（K248R）對禁食-再喂養(yǎng)調(diào)節(jié)具有抵抗力，并且不受Usp20缺陷的影響。L-Usp20-/-小鼠中較低的血清脂質(zhì)水平、增加的能量消耗和增加的葡萄糖清除被HMGCR（K248R）敲入逆轉(zhuǎn)。

????????作者接下來研究了L-Usp20-/-小鼠能量消耗增加的潛在機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)L-Usp20-/-小鼠肝臟中HMG-CoA的水平比野生型小鼠高67%。L-Usp20-/-小鼠肝臟中的乙酰乙酸酯也增加，盡管不顯著，而琥珀酰輔酶A減少了約44%， L-Usp20-/-肝臟中的琥珀酸增加了1.4倍。一致地，與野生型小鼠相比，L-Usp20-/-小鼠的血清琥珀酸水平翻了一番。三羧酸循環(huán)中的其他中間體和幾種已知的產(chǎn)熱因子在L-Usp20-/-小鼠中沒有顯著差異，并且未檢測到肝損傷?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Usp20的肝消融降低了HMGCR，后者反饋增加琥珀酸，隨后刺激產(chǎn)熱。

研究結(jié)論：長期HFHS飲食會(huì)長期激活mTORC1，通過磷酸化USP20和加劇代謝疾病來增加HMGCR水平。另一方面，Usp20的肝消融降低了HMGCR，后者反饋增加琥珀酸，隨后刺激產(chǎn)熱。

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6.USP20抑制劑的作用

????????USP20抑制劑GSK2643943A可用于研究USP20體內(nèi)藥理抑制的效果。GSK2643943A取消了重新喂養(yǎng)對HMGCR的誘導(dǎo)，同時(shí)其對磷酸化和總USP20的水平?jīng)]有影響。GSK2643943A在進(jìn)食狀態(tài)下將膽固醇生物合成減少了約50%。一致地，GSK2643943A處理降低了血清脂質(zhì)含量、改善葡萄糖清除并增加琥珀酸水平和能量消耗。作者研究了GSK2643943A是否可用于治療飲食誘導(dǎo)的肥胖和肥胖相關(guān)疾病。給野生型小鼠喂食HFHS飲食15周以誘導(dǎo)肥胖，然后通過口服強(qiáng)飼法給予載體或GSK2643943A。USP20的藥理學(xué)抑制不影響食物消耗或營養(yǎng)吸收，但通過減少脂肪量逐漸降低體重。用GSK2643943A處理后，肝臟、血清和脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)水平顯著降低。與對照小鼠相比，GSK2643943A處理的小鼠表現(xiàn)出更高的能量消耗和改善的葡萄糖清除率。Ucp1缺陷小鼠在GSK2643943A處理后沒有表現(xiàn)出代謝改善，表明這些影響依賴于UCP1。此外，GSK2643943A特異性降低野生型小鼠肝臟中的HMGCR水平，與其在野生型小鼠中的作用相反，GSK2643943A處理并未改變L-Usp20-/-小鼠中的能量消耗、葡萄糖清除率或血清脂質(zhì)水平。因此，GSK2643943A通過抑制肝臟USP20和HMGCR不穩(wěn)定來改善代謝疾病。

研究結(jié)論：GSK2643943A通過抑制肝臟USP20和HMGCR不穩(wěn)定來改善代謝疾病。

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結(jié)論與討論

????????mTORC1是一種重要的營養(yǎng)傳感器和進(jìn)食后能量儲(chǔ)存的組織者。結(jié)果顯示USP20位于mTORC1的下游以促進(jìn)膽固醇合成。首先，由于HMGCR蛋白水平降低, USP20活性的消耗減少了膽固醇生物合成。其次，因?yàn)閮?nèi)源性LXR配體不能有效產(chǎn)生甘油三酯和脂肪酸水平降低，從而降低SREBP1c和脂肪酸合成基因的表達(dá)。第三,USP20抑制顯著增加能量消耗，至少部分是通過琥珀酸濃度的增加。證實(shí)HMGCR是USP20的主要底物，并且解釋了Usp20缺乏促進(jìn)的代謝改善。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-020-2928-y