在日常生活中有三個(gè)區(qū)域可以鑒定出與酵母tRNA（His）鳥苷基轉(zhuǎn)移酶（Thg1）具有序列相似性的基因，Thg1家族酶涉及從tRNA（His）成熟到5'端修復(fù)到基因敲除等多種過程。 tRNA的所有這些活動(dòng)中都利用了Thg1家族酶催化3'-5'核苷酸的加成反應(yīng)能力。盡管許多含Thg1的生物中只有一個(gè)與Thg1相關(guān)的基因，但某些真核微生物卻擁有與Thg1序列相似的多個(gè)基因。

細(xì)菌tRNAHIS鳥苷基轉(zhuǎn)移酶（Thg1）樣蛋白的結(jié)構(gòu)研究，在激活和核苷酸轉(zhuǎn)移位點(diǎn)中具有的基因編輯技術(shù)

所有核苷酸聚合酶和轉(zhuǎn)移酶均在5'至3'方向中催化核苷酸的添加。相反，tRNAHis胍基轉(zhuǎn)移酶（Thg1）酶催化核苷酸向多核苷酸底物的反常添加（3'至5'）。在真核生物中，Thg1酶利用3'–5'附加活性將G-1添加到tRNAHis的5'末端，這是組氨酸-tRNA合成酶對(duì)tRNA進(jìn)行有效氨?；匦璧男揎?。 Thg1樣蛋白（TLP）基因敲除大腸桿菌和線粒體中發(fā)現(xiàn)，并且在生化上不同于其真核Thg1對(duì)應(yīng)物TLP催化截短的tRNA的5'端修復(fù)，其作用于廣泛的tRNA底物，而不是表現(xiàn)出嚴(yán)格的特異性tRNAHis。兩者合計(jì)，knockout bacteria這些數(shù)據(jù)表明TLPs在tRNAHis成熟途徑的不同生物學(xué)的過程中起作用，也許在tRNA質(zhì)量控制中。研究人員介紹了來自革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌（BtTLP）的TLP的第一個(gè)晶體結(jié)構(gòu)。該酶是類似于人THG1的四聚體，與它具有基本的結(jié)構(gòu)相似性。用5'-單磷酸化的tRNA催化3'-5'反應(yīng)首先需要一個(gè)激活步驟，即在第二個(gè)核苷酸基轉(zhuǎn)移步驟之前生成5'-腺苷酸化的中間體，其中核苷酸被轉(zhuǎn)移到tRNA的5'-末端。與人類THG1的早期特征一致，研究人員觀察到了激活和核苷酸轉(zhuǎn)移這兩個(gè)步驟中涉及的核苷酸的獨(dú)特結(jié)合位點(diǎn)。具有GTP的BtTLP復(fù)合物揭示了與GTP核苷酸在激活位點(diǎn)的新相互作用，這從先前解析的結(jié)構(gòu)中看不出來。此外，BtTLP-ATP結(jié)構(gòu)允許首次在激活位點(diǎn)直接觀察ATP。 BtTLP結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，結(jié)合所選變體的動(dòng)力學(xué)分析，提供了對(duì)關(guān)鍵殘基在激活步驟中的作用的新見解。

釀酒酵母Thg1使用5'-焦磷酸鹽去除控制核苷酸向tRNA的添加

在真核生物中，tRNA（His）鳥苷基轉(zhuǎn)移酶（Thg1）催化3'-5'將單個(gè)鳥苷殘基添加到tRNA（His）的-1位（G-1），跨過高度保守的73位腺苷（ A73）。加入G-1后，Thg1從tRNA 5'末端去除焦磷酸，生成5'-單磷酸化含有G-1的tRNA。 5'-單磷酸化的G-1殘基的存在，對(duì)于通過其組氨酸-tRNA合成酶識(shí)別tRNA（His）非常的重要。除單G-1加成反應(yīng)外，Thg1還將多個(gè)G殘基聚合到tRNA（His）變體的5'端。對(duì)于3'-5'聚合，Thg1使用tRNA（His）受體莖的3'末端作為模板。推測(cè)逆向聚合的機(jī)理涉及每個(gè)傳入的NTP對(duì)3'-OH的親核攻擊，該3'-OH對(duì)通過前面的核苷酸添加而產(chǎn)生的完整5'-三磷酸酯進(jìn)行了攻擊。在5'-焦磷酸鹽去除的3'-5'聚合酶反應(yīng)之間存在競(jìng)爭(zhēng)潛力，這可能確定了Thg1催化加成反應(yīng)的結(jié)果，但尚未研究出任何Thg1酶在這些競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)之間的相互作用。研究人員建立了瞬態(tài)動(dòng)力學(xué)測(cè)定法，以鑒定酵母Thg1具有一組tRNA（His）底物的焦磷酸鹽去除與核苷酸添加了活性之間的關(guān)系，其中N-1：N73堿基的身份發(fā)生變化，以模仿N-1的各種產(chǎn)物Thg1催化的加成反應(yīng)。研究人員證明5'-三磷酸的保留與有效的3'-5'逆向聚合相關(guān)。提出了一種動(dòng)力學(xué)分配機(jī)制，該機(jī)制可防止野生型tRNA（His）-1位以外的核苷酸添加。

Thg1型3'-5'核酸聚合酶中經(jīng)典RRM折疊棕櫚結(jié)構(gòu)域的存在以及GGDEF和CRISPR聚合酶結(jié)構(gòu)域的起源

使用敏感的分布圖比較結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法，我們顯示出催化結(jié)構(gòu)域Thg1包含RRM（鐵氧還蛋白）折疊棕櫚結(jié)構(gòu)域，就像病毒RNA依賴性RNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，A和B族DNA聚合酶，腺苷酸環(huán)化酶，雙鳥苷酸環(huán)化酶（GGDEF結(jié)構(gòu)域）和CRISPR系統(tǒng)的預(yù)期聚合酶。研究人員表明，就像在這些聚合酶中一樣，Thg1擁有一個(gè)帶有三個(gè)酸性殘基的活性位點(diǎn)，這些酸性殘基螯合Mg ++陽(yáng)離子。根據(jù)該研究人員的預(yù)測(cè)，Thg1類似于5'-3'聚合酶催化聚合反應(yīng)，但利用傳入的3'OH攻擊延伸的多核苷酸末端生成的5'三磷酸。此外，研究人員還確定了Thg1獨(dú)特這一組獨(dú)特殘基，研究人員預(yù)測(cè)這些殘基包含第二個(gè)活性定位點(diǎn)，該位點(diǎn)催化最初的腺苷酸化引發(fā)了3'-5'聚合反應(yīng)。從看到的信息顯示來自保守基因鄰域的背景Thg1資料，研究人員表明Thg1可能與多核苷酸激酶結(jié)合起作用，該多核苷酸激酶在RNA分子末端為其生成初始5'磷酸底物。除組氨酸t(yī)RNA成熟外，Thg1在生命的所有三個(gè)超級(jí)區(qū)域以及某些大型DNA病毒的代表中可能還具有其他RNA修復(fù)作用。研究人員還提供證據(jù)表明，在類似聚合酶的結(jié)構(gòu)域，證實(shí)兩人Thg1與GGDEF和CRISPR聚合酶蛋白催化結(jié)構(gòu)域的密切相關(guān)。

根據(jù)這種關(guān)系和這些酶的系統(tǒng)發(fā)育模式，我們推斷Thg1蛋白很可能代表同一類蛋白質(zhì)的古生真核分支，從而產(chǎn)生了可移動(dòng)的CRISPR聚合酶，并在細(xì)菌中產(chǎn)生了GGDEF結(jié)構(gòu)域。Thg1可能接近該酶家族的祖先版本，后者在最后一個(gè)通用祖先中可能在RNA修復(fù)中發(fā)揮了作用。Ubigene開發(fā)了CRISPR-B?，可優(yōu)化微生物基因編輯載體和工藝。效率和準(zhǔn)確性比傳統(tǒng)方法高得多。 CRISPR-B?可用于細(xì)菌和真菌的基因編輯。

Reference

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基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

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