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01：色譜柱平衡

Q（Jewel）：我想問個問題，我們現(xiàn)在用的色譜柱平衡時間一直在延長，之前10分鐘基本上就可以平衡好，現(xiàn)在需要三四十分鐘，不知道這是什么原因引起的？各位老師有遇到過類似的問題嗎？

A(小小哆啦夢吧):首先要確保流動相脫氣完全還有就是環(huán)境溫度哈，如果這些都沒有問題，我感覺主要還是跟你的色譜柱有關(guān)，新柱子填料的活性肯定相對比較好的，如果你走的是梯度，比較快的平衡方式，直接用你的方法進空針平衡，這樣會快一點感覺，只是個人建議，僅供參考哈

02：液相問題

Q(AB):請問液相的流速不準(zhǔn) 應(yīng)該怎么解決...沒有明顯漏液?

A(冬子╃Waters & Sciex):單向閥，柱塞桿和密封。。;二元泵還是四元泵。二元就兩個都測一下。。把正常的換到不正常的。。排查是單向閥還是柱塞桿和密封的問題。四元就只有拿好的配件測試了。。或者拆正常儀器的。。。

Q(AB):這些最近都換過了，單向閥只有出口閥沒有換 ，入口閥是新的，密封圈也是新?lián)Q的

A（肖燦）：你是怎么發(fā)現(xiàn)流速不準(zhǔn)？稱的還是流速劑？

Q(AB):用容量瓶看的

A(冬子╃Waters & Sciex):有一個判斷方法哈，把流動相的瓶子里面的濾頭提出來。吸一段小的氣泡在管路里面，然后讓泵一直運行，觀察氣泡。如果氣泡穩(wěn)定的往前走，可以有限考慮出口單向閥有問題。如果氣泡來回走，那大概率還是入口單向閥的問題

Q(AB):請問 這個流速應(yīng)該多大？想知道是什么原理..

A(冬子╃Waters & Sciex):正常運行流速。。吸液也排液的時候兩個單向閥是一個開，一個關(guān)。。吸液，入口開，出口關(guān)，排液，入口關(guān)，出口開。。如果排液的時候氣泡往回走，說明入口單向閥沒有正常關(guān)閉。吸液的時候氣泡不前移感覺應(yīng)該是出口單向閥沒完全關(guān)閉，導(dǎo)致吸液不正常。試試看，這個也沒有細想過。。主要日常都是用的Waters。配件多，不行就拆個正常的儀器換一換。。測試一波就能確認(rèn)問題了

Q(AB):試了一下 氣泡是往前走的? 是一下一下往前走 不是一直往前走的。請問是不是可以排查出口閥的問題

A(冬子╃Waters & Sciex):正常啊，吸液往前走，排液的時候氣泡應(yīng)該是不動的。。入口閥應(yīng)該沒啥事。

Q(AB):都是走的2毫升每分鐘流速，A泵流速明顯偏低了

A(冬子╃Waters & Sciex):把A泵和B泵的單向閥對換啊。二元泵先換入口，測一波，再換出口測一波。。要懷疑出口閥有問題?？梢韵葥Q出口閥。一次換一個

03：樣品中有機相占比

Q（楠）：各位大佬，我記得有法規(guī)規(guī)定，在生物樣品分析中，配置標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品時，血漿中的有機相比例不能大于5%，有知道哪個法規(guī)嗎？

A(蝸牛):查查ICH M10有沒有,有機相比例過高，空白血漿+標(biāo)液就會發(fā)生蛋白沉淀

Q（楠）：看了，沒看到。是的，我想看看法規(guī)原文，是說的必須，還是只是建議

A(蝸牛):業(yè)內(nèi)就這么定的，不超過5%，有的2%，不糾結(jié)。

A(我愛吃蝦):行業(yè)內(nèi)的潛規(guī)則，法規(guī)上沒有出處?？赡茉跉W美生物分析會議（WRIB）上有提到過

A(THINK):我好像記得血漿里面的添加物體積不能超過10%。一般標(biāo)準(zhǔn)品都是50%甲醇稀釋，這樣一看還真就是不大于5%

04：有機試劑中的異常分子量

Q（陳軍）：seen w/ silica capillary NanoSprayer 這句話精準(zhǔn)翻譯是什么？今天從制備乙腈中看到有個雜質(zhì)，大量存在，分子量536，查資料是這句英文。我還看到了391，應(yīng)該是塑化劑吧，這個。

A(我愛吃蝦):沒研究過。?高有機相沖儀器，看能降下來不

A(我愛吃蝦):額，換質(zhì)譜級的乙腈。也有嘛？

Q（陳軍）：那就沒有了，制備液相不至于這么奢侈

A(我愛吃蝦):或者甲醇這些試劑，是不是也有。

一般碰見這種情況，

1.更換廠家或提高試劑級別

2.如果確認(rèn)是質(zhì)譜中有的，就接二通，全掃描模式高有機相比例沖質(zhì)譜

3.叫工程師上門擼管子

A(我愛吃蝦):要么是試劑本身，要么是容器，換個玻璃瓶存放。

05：膽汁酸液質(zhì)方法殘留問題

Q（花醬）：各位大佬，想請教一個膽汁酸定量中的問題，檢測了幾個膽汁酸，發(fā)現(xiàn)殘留很嚴(yán)重，要走一針空白之后殘留才好一些，已經(jīng)把洗針液換成甲醇：乙腈：異丙醇：水了，洗針時間10s，還有什么辦法可以降低殘留呢？或者實在不行，可以每走一針樣品走一針空白嗎？這種操作有據(jù)可依嗎

A(rainy):初始流動相的有機相比例調(diào)高一些

A(我愛吃蝦):你確定是殘留？而不是因為待測物為內(nèi)源性物質(zhì)帶來的本底干擾。人體中可是有50多種膽汁酸，有的還同為同分異構(gòu)體，你都分開了嗎？

A(鄭八只):請問確定殘留的位置了嗎？如果更換了多種洗針，都沒有改善的話，考慮是不是殘留在柱子上呢

Q（花醬）：不是呢，我走的標(biāo)準(zhǔn)品。對，就是考慮殘留在柱子上了

A(鄭八只):可以調(diào)高初始有機相比例，如果殘留有改善的話，可能殘留在柱子上。是走了標(biāo)準(zhǔn)品，隨后走了溶劑，發(fā)現(xiàn)有殘留；還沒有上從基質(zhì)提取的樣品對嗎？

Q（花醬）：怎么說呢，都走過，因為殘留是走完樣品接著走空白的時候發(fā)現(xiàn)的，然后再走一針空白，幾乎就沒有殘留了

A(鄭八只):那我那我覺得還有把殘留調(diào)掉的希望！我們有的時候兩針空白殘留都下不了。如果懷疑和色譜柱有關(guān)的話，也可以嘗試更換色譜柱，比如色譜柱從C18變成C8，保留能力下降

A(我愛吃蝦):殘留可能來源：①系統(tǒng)中的死體積所產(chǎn)生；②由于吸附（耗材，管路）導(dǎo)致的殘留。③在色譜中不完全的洗脫形成的殘留。

殘留若無法消除，可以合理的安排樣品順序：如參考血藥代謝曲線濃度，將低濃度樣品安排在前，高濃度樣品靠后的方式，或在高濃度樣品后增加空白樣品來減少殘留

殘留解決方法，還是需要了解化合物的性質(zhì)合理配置洗針液，減少液相管路中的死體積等。一般多肽化合物或logP值比較高的小分子化合物在方法開發(fā)的時候就需要重點考察殘留了。

A(THINK):是什么柱子？我測膽汁酸的時候從來沒有殘留啊

Q（花醬）：是BEH C18

A(鄭八只):實際上我用C18，洗針用甲醇：水，也沒有殘留。也是測膽汁酸

A(LZH):基本沒有殘留的。主要考慮同分異構(gòu)體的區(qū)分。

A(LZH):方法可以同時檢測50種膽汁酸，其中包括30種游離型膽汁酸、8種甘氨酸結(jié)合型和12種?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸。不管從檢測通量，還是從方法選擇性以及方法靈敏度等方面看，這個方法都是幫你加速搬磚（膽汁酸）的不錯選擇。

特征譜圖

50種膽汁酸及其內(nèi)標(biāo)的特征色譜圖如下圖2。從譜圖可以看出，該方法可以基本實現(xiàn)50種膽汁酸的分離。另外，該方法大部分膽汁酸的LLOQ能達到0.08 nM水平。

圖2.?30種游離型膽汁酸（A) 和20種結(jié)合型膽汁酸（B）及其同位素內(nèi)標(biāo)（紅色）的色譜圖
具體參考文獻如下：https://doi.org/10.1021/ac503816u

06：大鼠膽汁酸采集

Q（甜甜）：誰采集過大鼠膽汁，一只大鼠能采多少毫升膽汁？

A(我愛吃蝦):大鼠無膽囊，但膽總管較大，可用膽總管插管，收集膽汁，研究消化功能。

膽汁采集需要進行膽管插管手術(shù)收集，按時間段收集，在動物活體狀態(tài)下，從膽管插管的管子中流出。一般活不過3天.一般24h有5-6ml

07：他克莫司穩(wěn)定性

Q（臨床質(zhì)譜解決方案-譜芬生物）：請教下各位，他克莫司內(nèi)標(biāo)在甲醇乙腈中一段時間后降解的快嗎

A(程):他克莫司，沒有穩(wěn)定性問題吧。是回收率有問題吧，要把紅細胞給破碎掉，釋放出藥物。

A(??):他克莫司臨床測了有20多年了吧，技術(shù)相當(dāng)成熟了

A(程):他克莫司，一般是測全血。甲醇乙腈無法使紅細胞完全破碎釋放出藥物，導(dǎo)致回收率偏低。一般要加 硫酸鋅

08：色譜柱平衡

Q（Jewel）：我想問個問題，我們現(xiàn)在用的色譜柱平衡時間一直在延長，之前10分鐘基本上就可以平衡好，現(xiàn)在需要三四十分鐘，不知道這是什么原因引起的？各位老師有遇到過類似的問題嗎？

A(小小哆啦夢吧):你的流動相是什么？

Q（Jewel）：千分之一甲醇水

A(小小哆啦夢吧):首先要確保流動相脫氣完全還有就是環(huán)境溫度哈，如果這些都沒有問題，我感覺主要還是跟你的色譜柱有關(guān)，新柱子填料的活性肯定相對比較好的，如果你走的是梯度，比較快的平衡方式，直接用你的方法進空針平衡，這樣會快一點感覺，只是個人建議，僅供參考哈

A（餅干）：平衡好是怎樣判斷的.壓力？基線噪聲？

Q（Jewel）：樣本剛開始不出峰，直到重復(fù)進樣多次后才出峰

09：流動相中有氣泡

Q（zhouzhou）：想問問大家，為什么我的A相管路里面總是很多氣泡？流動相配的時候，有超聲排氣泡，液相也有自動脫氣機。剛開始管路不會有氣泡，大概半個小時開始就會有氣泡。另外，出峰時間總是飄來飄去，但是峰形不受影響，很好。

A（【Ai】i HoMe）：是不是放在空調(diào)出風(fēng)口方位

A（收割機）：吸濾頭臟了？

A（AB）：氣泡那里出現(xiàn)？流動相到脫氣機管路？還是脫氣機出來到比例閥管路？

A（木字櫟）：我也有這種情況

A（AB）：正常，水相多就是這樣，你這個是管路外面，沒啥

Q（zhouzhou）：到脫氣機之前那一段，超聲過。我的是在里面

A（冬子╃Waters & Sciex）：可以換個流路試試看，看看時候管路有關(guān)系，還是跟流動相有關(guān)系

Q（zhouzhou）：我重新配了幾次，都是這樣。我的峰飄來飄去，應(yīng)該跟氣泡也有關(guān)系吧？

A（海闊天空）：可以看一下管路通路有接口的地方，重新接一下，可能會有松動的地方，容易進空氣，多purge一下管路，換一下過濾頭。溫度控制好，溫度高的話管路溶劑容易揮發(fā)進空氣

A（THINK）：不一定。你看到管道里面有氣泡了嗎？跟室溫也有關(guān)系。可能得換。我以前也遇到過，有時候洗了有改善，有時候依舊這樣

END

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