小鼠脾淋巴細胞分離及體淋巴增殖試驗

小鼠脾淋巴細胞的分離

首免后42天，每組取5只小鼠，取眼球采血后處死，分離脾淋巴細胞，具體操作步驟如下；

1、將采血后的小鼠脫頸處死后放入75%酒精中浸泡5min消毒，在超凈臺內(nèi)無菌操作分離脾臟，浸泡于RPMI-1640培養(yǎng)基（添加1%的雙抗）中。

2、研磨：在小皿中加入10ml RPMI-1640培養(yǎng)基，放置細胞濾網(wǎng)，用研磨棒在濾網(wǎng)中將脾細胞研磨成單個細胞，巴氏吸管吸取脾細胞懸液，再次經(jīng)過濾網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm/min離心10min。

3、裂解紅細胞：棄上清，加入5ml紅細胞裂解液重懸洗滌細胞，置于37℃溫箱裂解15min，1000rpm/min離心10min。

4、洗滌：棄掉上清，加入10ml RPMI-1640培養(yǎng)基重懸洗滌細胞，1000rpm/min離心10min，重復(fù)洗滌兩次。

5、計數(shù)：用5ml 10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基重懸脾淋巴細胞，使用細胞計數(shù)儀對細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1x107cell/ml備用。

脾淋巴細胞增殖檢測

脾淋巴細胞在體外經(jīng)過某種物質(zhì)刺激，會產(chǎn)生一系列增殖的變化，據(jù)此可以判斷出淋巴細胞對有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)，本實驗通過CCK-8法檢測小鼠脾淋巴細胞在體外刺激后的增殖能力，具體操作步驟如下：

1、將制備好的小鼠脾淋巴細胞懸液加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100ul（1x106 cells）。

2、檢測孔每孔加入10ul多肽，陽性對照孔每孔加入10ul RPMI-1640稀釋的ConA（終濃度5ug/ml）,陰性對照孔每孔加入10ul RPMI-1640培養(yǎng)基。向細胞板最外側(cè)一圈加入100ul培養(yǎng)基防止內(nèi)側(cè)孔內(nèi)液體蒸發(fā)影響實驗結(jié)果。將細胞板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44h。

3、每孔加入10ul CCK-8溶液，再培養(yǎng)4h。

4、取出細胞板，使用酶標儀讀取OD450nm值。

ELISASpot檢測小鼠分泌IFN-r/IL-4的淋巴細胞數(shù)量

T淋巴細胞免疫激活后，CD4+T細胞分化為Th1和Th2細胞，IFN-r是Th1型細胞的標志性細胞因子，IL-4是Th2型細胞的標志性細胞因子。為了檢測特異性T淋巴細胞反應(yīng)，通過ELISASpot測定小鼠脾淋巴細胞中分泌IFN-r/IL-4的細胞數(shù)量，具體操作步驟如下：

1、預(yù)包被板的活化：向預(yù)包被板中每孔加入200ul RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫靜置5-10min進行活化，甩掉孔內(nèi)培養(yǎng)基。

2、細胞孵育：每孔加入制備好的脾淋巴細胞懸液100ul（1x106 cells），背景負對照孔 加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)基。檢測孔每孔加入10ul多肽，陽性對照孔每孔加入10ul陽性刺激工作液，負對照孔、背景負對照孔加入10ul RPMI-1640培養(yǎng)基。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育18h.

3、裂解細胞：棄去（傾倒）孔內(nèi)細胞及培養(yǎng)基，加入冰冷的去離子水，200ul/孔，4℃冰箱放置10min低滲裂解細胞。

4、洗板：甩出孔內(nèi)液體，加入1xWashing buffer 260ul/孔，靜置1min后棄去，在吸水紙上扣干，重復(fù)6次。

5、孵育檢測抗體：將稀釋的Biotiny lated antibody 加入實驗孔，100ul/孔，37℃孵育1h。

6、酶聯(lián)親和孵育：洗板后，將稀釋好的Streptavidin-HRP加入實驗孔，100ul/孔，37℃孵育1h。

7、洗板：甩出孔內(nèi)液體，加入1xWashing Buffer，260ul/孔，靜置1min后棄去，在吸水紙上扣干，重復(fù)5次，揭開板子底座，用去離子水洗滌膜底面及底座，用吸水紙小心吸干膜底面及底座殘留的水跡，合上底座，加入1xWashing Buffer，260ul/孔，靜置1min后棄去，徹底扣干孔內(nèi)液體。

8、顯色：配制ACE顯色液，加入各實驗孔，100ul/孔，37℃溫箱避光15min，根據(jù)斑點生成情況選擇終止顯色時間。

9、終止顯色：甩出孔內(nèi)液體，揭開板子底座，用去離子水洗滌膜底面及底座3-5遍，終止顯色。將板子放置在室溫陰涼處，待其自然晾干后合上底座。

10、使用Mabtech ASTOR ELISpot讀板儀進行斑點計數(shù)并分析。

物品清單

8.27的細胞免疫檢測-物品清單

4%的多聚甲醛-固定淋巴結(jié)

巴氏吸管

紅細胞裂解液

FBS血清

15ml離心管

刀豆蛋白

表位多肽

細胞計數(shù)板

70目網(wǎng)篩

研磨棒

1640培養(yǎng)基

雙抗

50ml離心管

滅菌剪刀鑷子

75%的酒精

泡沫板

針頭固定