肝臟作為人體五臟之一，與機(jī)體正常的代謝、解毒、凝血等過程息息相關(guān)，并且參與機(jī)體免疫，是維持機(jī)體生命不可缺少的重要器官。在進(jìn)行肝臟疾病的研究中，合適的細(xì)胞模型是重要的工具之一，但由于常規(guī)肝細(xì)胞獲取困難、培養(yǎng)難度高、培養(yǎng)成本高昂，在一定程度上制約了肝臟疾病研究的發(fā)展。因此，在肝臟研究中選擇培養(yǎng)簡單、遺傳背景穩(wěn)定的肝細(xì)胞系則成為了一種替代選擇，其中Huh-7是最為常用肝癌細(xì)胞系之一。

Huh-7肝細(xì)胞系的應(yīng)用

Huh-7細(xì)胞系由Nakabayshi、H.和Sato，J建立于1982年，是從一名57歲的日本男性的肝臟腫瘤中提取的高分化肝細(xì)胞來源的癌細(xì)胞系，呈上皮樣形態(tài)。大多數(shù)Huh-7細(xì)胞的染色體數(shù)目在55 - 63之間，具有高度異質(zhì)性。

• 肝炎病毒研究

  Huh-7對丙肝病毒(HCV)高度敏感，到目前為止，Huh-7及其衍生細(xì)胞株是唯一能夠有效復(fù)制丙型肝炎病毒（HCV）的細(xì)胞系，因此Huh-7常被用作研究HCV的模型?？捎糜诤Y選抗丙型肝炎病毒的候選藥物，和開發(fā)抗丙型肝炎的新藥。

• 異種移植模型

  可用于建立細(xì)胞系來源的異種移植（Cell Line Derived Xenograft, CDX）小鼠模型，即Huh-7 CDX模型。此模型可用于臨床前腫瘤生長抑制的研究，包括激酶抑制劑(例如.BZG-4000）、FGFR4、抗EGFRvIII抗體等新型抗腫瘤生長療法(例如sorafenib和silibinin）。

• 藥物研究

  可用于研究肝癌藥物藥效、代謝，并探討藥物的分子機(jī)制。

肝細(xì)胞系與CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合，為癌癥、藥物代謝和冠狀病毒等研究提供新思路！

利用CRISPR/Cas9敲除Huh-7的病毒復(fù)制關(guān)鍵宿主因子，探索冠狀病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因CypA（環(huán)孢素A結(jié)合蛋白）是許多RNA病毒復(fù)制的重要宿主因子。此外，有些報道稱，一些病毒的復(fù)制在不同程度上依賴于CypA。這些研究由于使用了不同的病毒、細(xì)胞系和實驗設(shè)計，因此很難進(jìn)行比較?？茖W(xué)家研究了三種可以在Huh-7細(xì)胞中復(fù)制的單鏈正義RNA病毒的CypA依賴性，分別是馬動脈炎病毒（EAV）、人類冠狀病毒（HCoV-229E）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。通過比較這些病毒在同一親本Huh-7細(xì)胞，和用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的CypA基因敲除Huh-7細(xì)胞中的復(fù)制。

通過核轉(zhuǎn)染法將分別打靶 CypA, CypB, CypC和CypD的sgRNA轉(zhuǎn)入Huh-7細(xì)胞中，篩選后獲得陽性cell pool。Huh-7 Cyp KO細(xì)胞池感染MERS-CoV（B）、HCoV-229E（C）或EAV（D），MOI為0.01。用菌斑法測定48h p.i.（B，C）或32h p.i.（D）時的病毒產(chǎn)量。在所有四個CypKO細(xì)胞池中，MERS-CoV和HCoV-229E的滴度沒有改變（B和C）。在感染Huh-7 CypA KO細(xì)胞池后，EAV病毒滴度降低了2-logs，但在其他敲除細(xì)胞池中沒有改變。這證明了CypA對EAV的復(fù)制起到重要作用。

由于Huh7 CypA-KO細(xì)胞池可能存在低水平的CypA表達(dá)殘留，這可能仍然足以支持正常水平的MERS-CoV和HCoV-229E復(fù)制，因此需要獲得Huh7CypA-KO單克隆。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測序驗證，篩選出CypA敲除的陽性克隆。野生型Huh-7細(xì)胞和Huh-7

CypA-KO克隆#1和#2均感染MERS-CoV、HCoV-229E或EAV。在這兩個CypA-KO細(xì)胞克隆中，CypA表達(dá)的失活顯著降低了MERS-CoV的復(fù)制（約3倍）。有趣的是，在這兩個克隆中，沒有發(fā)現(xiàn)HCoV-229E缺乏CypA的影響（D）。然而，對于EAV，觀察到病毒產(chǎn)量的~3-log下降（E），與之前使用的Huh-7 CypA-KO細(xì)胞池相比，表現(xiàn)出10倍強(qiáng)的抑制作用。

綜上，在CypB-KO、CypC-KO或CypD-KO細(xì)胞池中MERS-CoV、HCoV-229E和EAV的復(fù)制沒有改變，這表明在Huh-7細(xì)胞中，這些病毒的復(fù)制不依賴CypB、CypC或CypD。然而，與CypA的情況一樣，我們不能排除（非常）低水平的cyp仍然足以支持有效的病毒復(fù)制的可能性。敲除CypA使EAV產(chǎn)量降低約3-log，而MERS-CoV子代滴度降低約3倍，HCoV-229E復(fù)制沒有改變。這項研究表明，不同單鏈正義RNA病毒的復(fù)制對細(xì)胞CypA的依賴性有顯著差異。

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除和點(diǎn)突變Huh-7藥物代謝模型，便于研究不同基因差異對藥物代謝的影響

體外研究藥物代謝和相關(guān)基因變異常常會使用新鮮分離培養(yǎng)或冷凍保存的人和動物肝細(xì)胞；然而，原代肝細(xì)胞不是最佳選擇，因為它們需要收集肝，價格昂貴；而且它們不是永生化的，在不同的樣本之間存在較大差異。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞系在基因組上是相同的。因此， 研究者開發(fā)了一種CRISPR/Cas9基因修飾的人肝細(xì)胞系，可持續(xù)性地研究基因變異對藥物代謝影響。研究CYP3A5的變異分別對鎮(zhèn)靜藥或麻醉藥咪達(dá)唑侖（MDZ）和免疫抑制劑他克莫司（Tac）這兩種酶底物代謝的影響。

大約50%的口服藥物由CYP3A4和CYP3A5代謝。在P450酶中，CYP3A4和CYP3A5在肝臟中最為豐富，其表達(dá)具有高度的變異性。CYP3A5*3（rs776746）等位基因功能缺失在白種人中非常普遍。與具有CYP3A5*1基因型的個體相比，Tac的代謝率較低；然而，CYP3A5*1等位基因在非裔美國人中富集，MDZ、Tac和其他藥物的快速代謝。因此，CYP3A5基因型是決定藥物適宜劑量的重要因素。

到目前為止，還沒有商業(yè)化的肝細(xì)胞系在7號染色體上二倍體并表達(dá)CYP3A5*1。Huh-7細(xì)胞系能通過CYP3A4活性將底物MDZ轉(zhuǎn)化為其代謝產(chǎn)物羥基化的1-OH-MDZ和4-OH-MDZ；然而，Huh-7細(xì)胞在MDZ代謝方面不是很有效，因為它們是CYP3A5*3等位基因的純合體。因此，有必要開發(fā)一種肝細(xì)胞系，可以在細(xì)胞培養(yǎng)中模擬與CYP3A5*1基因型相關(guān)的藥物快速代謝過程。

通過核轉(zhuǎn)染法將gRNA和Cas9以及ssODN共轉(zhuǎn)入Huh-7細(xì)胞中，篩選后挑取單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測序驗證，篩選出基因敲除的陽性克隆。通過敲除或點(diǎn)突變CYP3A5*3的外顯子3B的剪接連接點(diǎn)，從而獲得了三個CYP3A5*1細(xì)胞系。

與野生型Huh-7相比，CYP3A5*1/*3sd（雜合子KO）、CYP3A5*1/*1dd（純合子KO）或CYP3A5*1/*3pm（點(diǎn)突變）表達(dá)CYP3A5*1的mRNA，CYP3A5的mRNA和蛋白表達(dá)均升高。因此，通過CRISPR/Cas9技術(shù)，成功將*3基因型轉(zhuǎn)化為*1基因型，由此激活Huh-7細(xì)胞系中CYP3A5的表達(dá)。這個細(xì)胞模型可以加快臨床前的藥物開發(fā)，節(jié)省時間和金錢，更準(zhǔn)確地預(yù)測不同人群或基因型的藥物代謝、藥代動力學(xué)、毒性和療效。

CRISPR/Cas9技術(shù)將GFP敲入Huh-7細(xì)胞的Nanog，揭示肝細(xì)胞癌發(fā)病率存在性別差異的原因

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯的性別差異——明顯傾向于男性。有研究證明，雄激素/雄激素受體信號軸和前列腺癌、宮頸癌等多種激素相關(guān)性腫瘤的發(fā)病具有相關(guān)性。而肝臟作為雄激素代謝的重要場所，其微環(huán)境中雄激素水平也較高，肝細(xì)胞癌似乎與雄激素/雄激素受體信號軸有著密切關(guān)系。

腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cells，CSCs）與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，其具有自我更新和無限增殖的能力，是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵因素。有研究揭示，多能性因子Nanog參與維持CSCs的干性。但雄激素/雄激素受體信號軸是否通過Nanog相關(guān)途徑對HCC細(xì)胞的干性維護(hù)產(chǎn)生影響，目前尚不清楚。

研究者發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中，雄激素受體表達(dá)非常高，并與Nanog相關(guān)。隨后，通過CRISPR/Cas9將GFP標(biāo)記huh7細(xì)胞內(nèi)源性Nanog，證實了雄激素受體和Nanog在HCC細(xì)胞中的共定位。通過核轉(zhuǎn)染法將gRNA、Cas9和Donor共轉(zhuǎn)入huh-7細(xì)胞中，進(jìn)行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測序，篩選出敲入純合的陽性克隆。

這些研究結(jié)果顯示， 雄激素/雄激素受體信號軸通過影響腫瘤細(xì)胞的干性，為HCC療法中的這個軸抑制提供了證據(jù)，為肝癌治療中軸突的抑制提供了一種可能的途徑。.

通過后續(xù)的體外實驗，研究者證明了該信號軸可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的干性，這種作用是以Nanog依賴性的方式并通過激活其轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的，而這種作用可以通過雄激素阻斷或AR降解增強(qiáng)子或而被抑制。

CRISPR-U?可在肝細(xì)胞系中進(jìn)行高效的基因編輯

CRISPR-U?是源井生物自主研發(fā)的應(yīng)用于基因編輯細(xì)胞系的獨(dú)家技術(shù)，通過優(yōu)化基因編輯載體和基因編輯流程，CRISPR-U?技術(shù)的基因切割效率和重組效率是普通的CRISPR/Cas9技術(shù)的10倍以上，可輕松定制KO、KI、點(diǎn)突變肝細(xì)胞系，亦可實現(xiàn)各種穩(wěn)轉(zhuǎn)株需求。

Reference：

de Wilde A H, Zevenhoven-Dobbe J C, Beugeling C, et al. Coronaviruses and arteriviruses display striking differences in their cyclophilin A-dependence during replication in cell culture[J]. Virology, 2018, 517: 148-156.

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Jiang L, Shan J, Shen J, et al. Androgen/androgen receptor axis maintains and promotes cancer cell stemness through direct activation of Nanog transcription in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7(24): 36814.

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