寫在前面

????????今天推薦的是由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系在2021年7月29日發(fā)表于Aotuphagy（2020IF：16.016，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Weilin Chen教授，研究表明USP19（泛素特異性肽酶19）通過分子伴侶介導(dǎo)的自噬促進(jìn)TBK1（TANK結(jié)合激酶1）降解。

研究背景

????????TBK1（TANK結(jié)合激酶1）是先天免疫反應(yīng)所需的必需受體蛋白，但調(diào)控TBK1穩(wěn)定性的機(jī)制，尤其是那些通過自噬調(diào)節(jié)的機(jī)制，仍然知之甚少。

摘要部分

????????在這里，作者證明USP19（泛素特異性肽酶19）通過分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）與TBK1溶酶體相互作用并促進(jìn)其降解。作者觀察到TBK1具有典型的CMA基序，可減弱參與CMA的關(guān)鍵蛋白的作用或抑制CMA阻止的USP19介導(dǎo)的TBK1降解。此外，巨噬細(xì)胞中USP19缺陷導(dǎo)致TBK1升高和水泡性口炎病毒(VSV)感染后I型干擾素信號(hào)通路的激活。一致地，小鼠中巨噬細(xì)胞特異性u(píng)sp19敲除導(dǎo)致VSV復(fù)制減弱和體內(nèi)VSV感染抵抗。總而言之，作者的結(jié)果表明USP19是TBK1的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，并揭示了USP19在CMA介導(dǎo)的TBK1降解和傳染病中的作用。

研究?jī)?nèi)容

1.USP19促進(jìn)TBK1溶酶體降解? ? ?

????????TBK1是對(duì)病毒和細(xì)菌感染的先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。為了確定可能調(diào)節(jié)TBK1穩(wěn)定性的去泛素化酶，作者將TBK1和DUB表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并通過免疫印跡法分析去泛素化酶。作者發(fā)現(xiàn)USP19可以促進(jìn)TBK1的降解。免疫印跡法顯示，TBK1蛋白水平以USP19劑量依賴的方式減少。此外，與對(duì)照組相比，USP19在293T細(xì)胞中的過表達(dá)降低了TBK1的半衰期。這些結(jié)果表明，USP19促進(jìn)了TBK1的降解。蛋白質(zhì)降解主要通過兩種途徑發(fā)生：蛋白酶體依賴性途徑和溶酶體依賴性途徑。作者用蛋白酶體抑制劑（MG132）、溶酶體抑制劑（CQ）、3-MA或自噬體融合抑制劑Baf-A1處理這些細(xì)胞。只有CQ處理能抑制TBK1的降解，表明USP19以溶酶體依賴性的方式促進(jìn)TBK1的降解。

????????由于USP19是一種去泛素化酶，作者接下來(lái)探究了TBK1蛋白泛素化狀態(tài)是否受到USP19的影響。HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染泛素、USP19和TBK1表達(dá)質(zhì)粒，然后用MG132或CQ處理，作者發(fā)現(xiàn)USP19調(diào)節(jié)TBK1降解與泛素?zé)o關(guān)。此外，USP19的過表達(dá)并不影響TBK1的聚泛素化。作者接下來(lái)研究了USP19的去泛素化酶活性是否影響TBK1蛋白水平。作者構(gòu)建了一個(gè)含有C607S替換的無(wú)酶USP19突變體質(zhì)粒（Flag-USP19 C607S）。免疫印跡分析表明，USP19促進(jìn)TBK1的降解與它的去泛素化酶的活性無(wú)關(guān)。

研究結(jié)論：USP19以溶酶體依賴性的方式促進(jìn)TBK1的降解，但與USP19的去泛素化酶活性無(wú)關(guān)。

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2.TBK1通過其激酶域(KD)與USP19泛素特異性肽酶(USP)域相互作用

????????為了研究USP19是否可以與TBK1相互作用，作者在293T細(xì)胞中表達(dá)了Flag-USP19和MYC-TBK1質(zhì)粒并進(jìn)行了免疫共沉淀試驗(yàn)。作者觀察到USP19與TBK1相關(guān)。由于TBK1是參與抗病毒免疫反應(yīng)的重要受體，作者還在HeLa和THP1細(xì)胞中檢測(cè)到USP19和TBK1之間的內(nèi)源性相互作用。為了進(jìn)一步證實(shí)這些結(jié)果，作者進(jìn)行了體外結(jié)合測(cè)定，結(jié)果表明USP19可以在體外與TBK1相互作用。作者的結(jié)果還表明USP19 C607S可以與TBK1相互作用。此外，作者構(gòu)建了三個(gè)截?cái)嗟腡BK1突變體來(lái)探索哪些域介導(dǎo)了與USP19的這種相互作用。這些截?cái)嗤蛔凅w的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，TBK1ULD+CC域截?cái)嗤蛔凅w無(wú)法與USP19相互作用，而TBK1WT、KD和KD+ULD仍可與USP19相互作用。這些數(shù)據(jù)支持TBK1通過其激酶域與USP19相互作用的假設(shè)。

研究結(jié)論：USP19和TBK1分別通過它們的USP和激酶結(jié)構(gòu)域相互作用。

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3.USP19通過伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬促進(jìn)TBK1降解? ? ?

????????接下來(lái)，作者研究了USP19對(duì)TBK1的負(fù)向調(diào)節(jié)的機(jī)制。以前的研究表明，USP19促進(jìn)自噬，作者的數(shù)據(jù)證實(shí)，過量表達(dá)USP19，而不是USP19 C607S增加了HeLa細(xì)胞的LC3B裂解。然而，作者還發(fā)現(xiàn)，只有溶酶體抑制劑CQ可以抑制TBK1的降解，表明USP19促進(jìn)TBK1的降解與巨噬作用無(wú)關(guān)。

????????此外，在比較不同物種間TBK1的氨基酸序列后，作者發(fā)現(xiàn)TBK1表現(xiàn)出一個(gè)典型的CMA基序（KFDKQ），表明USP19可能以CMA依賴的方式促進(jìn)TBK1的降解。LAMP2A和HSPA8是參與CMA的核心蛋白：HSPA8識(shí)別目標(biāo)蛋白的CMA基序并與之相互作用，而位于溶酶體膜上的LAMP2A則促進(jìn)目標(biāo)蛋白進(jìn)入溶酶體進(jìn)行降解。免疫熒光染色顯示，USP19與TBK1和LAMP2A共同定位，共同免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，USP19與TBK1、LAMP2A和HSPA8相互作用。此外，作者還通過溶酶體分離實(shí)驗(yàn)證明了TBK1和USP19蛋白在溶酶體中的存在。就其對(duì)TBK1穩(wěn)定性的影響而言，LAMP2A或HSPA8的過表達(dá)增強(qiáng)了USP19介導(dǎo)的TBK1降解，而CQ處理則抑制了它。作者接下來(lái)構(gòu)建了一個(gè)TBK1CMA-動(dòng)點(diǎn)突變體質(zhì)粒，含有Q588A的替換（MYC-TBK1Q588A），并將MYC-TBK1或MYC-TBK1Q588A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到有或沒有Flag-USP19質(zhì)粒的tbk1-基因剔除的RAW264.7細(xì)胞。結(jié)果顯示，USP19沒有促進(jìn)TBK1 CMA基序突變體蛋白的降解。有趣的是，USP19的過表達(dá)增加了LAMP2A和HSPA8在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并促進(jìn)了HSPA8和LAMP2A之間的相互作用。這一發(fā)現(xiàn)表明，USP19可能具有多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)LAMP2A和HSPA8的mRNA表達(dá)。重要的是，siRNA介導(dǎo)的對(duì)LAMP2A或HSPA8表達(dá)的敲低抑制了USP19介導(dǎo)的TBK1降解。VER-155,008是一種可以抑制CMA的HSPA8抑制劑，而Torin1是一種可以誘導(dǎo)CMA的強(qiáng)效mTOR抑制劑。當(dāng)作者用VER155,008處理HeLa細(xì)胞時(shí)，作者觀察到USP19調(diào)節(jié)的TBK1降解大大減少；相反，Torin1處理明顯促進(jìn)USP19調(diào)節(jié)的TBK1降解。

研究結(jié)論：USP19通過CMA促進(jìn)TBK1的降解。

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4.USP19通過促進(jìn)TBK1降解負(fù)向調(diào)節(jié)IFNB產(chǎn)生和細(xì)胞抗病毒反應(yīng)

????????TBK1是一種必需的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與病毒觸發(fā)的I型IFN信號(hào)傳導(dǎo)。作者設(shè)計(jì)了一個(gè)USP19特異性siRNA來(lái)探索USP19是否調(diào)節(jié)了TBK1依賴性抗病毒反應(yīng)。qPCR和ELISA顯示USP19敲低增強(qiáng)了VSV誘導(dǎo)的THP-1或HeLa細(xì)胞中的IFNB1表達(dá)，但CMA抑制劑并未進(jìn)一步促進(jìn)IFNB1表達(dá)。THP-1或HeLa細(xì)胞中的USP19敲低也顯著促進(jìn)了VSV誘導(dǎo)的CCL5和CXCL10 mRNA表達(dá)，表明USP19通過促進(jìn)CMA介導(dǎo)的TBK1降解負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)。

????????病毒感染可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素，然后觸發(fā)Janus激酶(JAK)——信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)通路的激活以及干擾素刺激基因(ISG)的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)這些ISG在USP19敲低細(xì)胞中的表達(dá)增加，并且用VER-155,008處理的USP19敲低細(xì)胞和對(duì)照之間沒有顯著差異。為了觀察細(xì)胞中VSV的復(fù)制，作者用GFP標(biāo)記的VSV感染了THP-1和HeLa細(xì)胞。與對(duì)照細(xì)胞相比，USP19敲低細(xì)胞中的GFP熒光強(qiáng)度顯著降低。流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，與對(duì)照細(xì)胞相比，USP19敲低細(xì)胞中GFP+細(xì)胞的百分比顯著降低。作者還測(cè)試了內(nèi)源性TBK1水平，結(jié)果表明USP19敲低明顯抑制了內(nèi)源性TBK1降解。這些結(jié)果表明，USP19敲低通過抑制TBK1降解來(lái)增強(qiáng)IFNB產(chǎn)生和細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。

????????為了表明USP19靶向TBK1以負(fù)調(diào)節(jié)抗病毒反應(yīng)，作者進(jìn)行了IFNB1和干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)啟動(dòng)子報(bào)告基因檢測(cè)。過表達(dá)USP19抑制了TBK1，上游調(diào)節(jié)因子DDX58/RIG-I和MAVS過表達(dá)誘導(dǎo)了IFNB1和ISRE啟動(dòng)子活性。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示USP19和DDX58、MAVS、IRF3、IFIH1/MDA5、CGAS或STING1之間沒有相互作用。這些數(shù)據(jù)表明USP19通過促進(jìn)TBK1降解負(fù)向調(diào)節(jié)TBK1依賴性細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。

研究結(jié)論：USP19通過促進(jìn)TBK1降解負(fù)向調(diào)節(jié)IFNB產(chǎn)生和細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。

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5.敲除人PBMCs中的USP19促進(jìn)VSV誘導(dǎo)的IFNB產(chǎn)生和細(xì)胞抗病毒反應(yīng)

????????為了探索以上發(fā)現(xiàn)的潛在臨床價(jià)值，作者接下來(lái)探究了USP19對(duì)原代人類外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的影響。USP19-siRNA 處理抑制了 PBMC 中 USP19 的表達(dá)。感染VSV后，USP19敲低PBMC表達(dá)更高水平的IFNB1 mRNA，且產(chǎn)生比VSV感染的對(duì)照細(xì)胞更多的IFNB蛋白。在感染了VSV的USP19基因敲除的PBMC中，病毒的復(fù)制受到了抑制。同樣，經(jīng)VER-155,008預(yù)處理的USP19-基因敲除的PBMCs也沒有表現(xiàn)出比USP19-基因敲除的PBMCs更強(qiáng)的病毒反應(yīng)。接下來(lái)，作者探究了USP19對(duì)VSV誘導(dǎo)的信號(hào)通路激活的影響。TBK1蛋白的表達(dá)在USP19敲低的PBMCs中大幅上升，這表明USP19通過靶向TBK1而對(duì)抗病毒反應(yīng)產(chǎn)生了消極影響。最后，作為干擾素的下游信號(hào)分子，STAT1和STAT2在USP19基因敲低的PBMC感染VSV后明顯增加。

研究結(jié)論：USP19對(duì)IFNB的產(chǎn)生和細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

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6.USP19缺乏通過抑制CMA介導(dǎo)的TBK1降解增強(qiáng)了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中I型干擾素的產(chǎn)生和抗病毒反應(yīng)

????????為了進(jìn)一步研究USP19在體外和體內(nèi)抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，作者構(gòu)建了Usp19fl/fl小鼠。qPCR分析表明，usp19敲除顯著促進(jìn)了VSV或轉(zhuǎn)染的poly(I:C)誘導(dǎo)的小鼠色調(diào)巨噬細(xì)胞中的Ifna4和Ifnb1表達(dá)，而VER-155,008沒有這種效果。在來(lái)自Usp19fl/fl小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中，作者發(fā)現(xiàn)USP19負(fù)向調(diào)節(jié)單純皰疹病毒(HSV)誘導(dǎo)的Ifnb1、Ifna4和Isgs mRNA表達(dá)。此外，作者的結(jié)果表明，Ifnb1 mRNA在usp19基因敲除巨噬細(xì)胞中以較高水平表達(dá)，這些巨噬細(xì)胞受到Toll樣受體刺激物的刺激。這些結(jié)果證實(shí)USP19通過靶向TBK1負(fù)向調(diào)節(jié)Ifnb1表達(dá)。同樣，在VSV感染的巨噬細(xì)胞中敲除usp19表達(dá)更高水平的Ccl5和Cxcl10 mRNA和Isg mRNA。此外，敲除usp19的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞在OAS1和EIF2 AK2/PKR下游表達(dá)更高水平的I型干擾素。另一方面，巨噬細(xì)胞中USP19的缺失導(dǎo)致LAMP2A蛋白表達(dá)降低，表明usp19敲除削弱了巨噬細(xì)胞中的CMA。作者接下來(lái)通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析監(jiān)測(cè)VSV復(fù)制，以檢測(cè)VSV-GFP感染后的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果表明，與Usp19 WT細(xì)胞相比，usp19缺陷降低了GFP強(qiáng)度和GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。VSV RNA水平的qPCR分析也表明usp19敲除顯著抑制了VSV復(fù)制。

????????作者進(jìn)一步研究了USP19對(duì)VSV誘導(dǎo)的信號(hào)通路激活的影響。在usp19基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，VSV感染后IRF3磷酸化和TBK1蛋白的表達(dá)顯著升高，而其他參與VSV誘導(dǎo)信號(hào)通路的蛋白質(zhì)不受影響，表明USP19靶向TBK1并促進(jìn)其降解以負(fù)調(diào)節(jié)抗病毒反應(yīng)。最后，在usp19基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，VSV感染后STAT1和STAT2磷酸化顯著增加。

研究結(jié)論：USP19缺乏會(huì)增強(qiáng)I型干擾素的產(chǎn)生并促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中VSV誘導(dǎo)的病毒信號(hào)激活。

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7.USP19缺陷增強(qiáng)了宿主對(duì)VSV感染的反應(yīng)

????????在體內(nèi)，作者通過腹腔注射VSV對(duì)Usp19fl/fl小鼠、usp19fl/flLyz2-Cre小鼠和VER-155,008預(yù)處理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠進(jìn)行處理。qPCR分析顯示，VSV感染后，usp19fl/flLyz2-Cre小鼠在各個(gè)器官表達(dá)的Ifna4和Ifnb1水平高于Usp19fl/fl小鼠，而且VER-155,008處理并沒有進(jìn)一步促進(jìn)VSV感染后usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的Ifna4和Ifnb1表達(dá)。在usp19fl/flLyz2-Cre小鼠或經(jīng)VER-155,008處理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的這些器官中，VSV滴度和復(fù)制明顯低于Usp19fl/fl小鼠。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的結(jié)果也表明，與Usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的血清相比，VER-155,008預(yù)處理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠血清中的IFNB產(chǎn)生量明顯增加。作者還觀察到，與Usp19fl/fl小鼠相比，感染VSV后，usp19fl/flLyz2-Cre小鼠肺部的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，組織損傷輕微，而usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與VER-155,008預(yù)處理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠相比，沒有明顯差異。更重要的是，與Usp19fl/flLyz2-Cre小鼠相比，usp19fl/flLyz2-Cre小鼠在總體存活率方面表現(xiàn)出對(duì)VSV感染的高度抗性。

研究結(jié)論：USP19抑制IFNB的產(chǎn)生，并抑制體內(nèi)VSV感染情況下的抗病毒先天反應(yīng)。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者的結(jié)果確定了USP19通過CMA促進(jìn)TBK1降解的新功能，并表明USP19通過上調(diào)LAMP2A和HSPA8表達(dá)促進(jìn)CMA，但詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。這一發(fā)現(xiàn)表明, USP19在針對(duì)病毒的先天免疫反應(yīng)中起著決定性作用，并為某些傳染病提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1080/15548627.2021.1963155

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