編者按

新冠抗“疫”不斷，科研腳步不停歇

我們在做好自身防護，抗擊疫情的同時。作為科研人，在科研路上的腳步卻未停歇。本期小鹿帶來客戶文章解讀，運用16S+代謝組學，揭示擬南芥根部微生物將色氨酸轉(zhuǎn)化為植物激素吲哚乙酸從而延遲開花的代謝調(diào)控網(wǎng)絡和作用機制。

（圖片來源于“央視新聞”）

前言

氣候變化改變了植物物候?qū)W。這對生物圈和地球系統(tǒng)具有重要的生物、物理和化學影響。這些物候變化已成為生態(tài)學和環(huán)境科學的一個重要課題。本篇為鹿明生物合作客戶浙江工業(yè)大學環(huán)境學院陸濤博士團隊在一區(qū)期刊Microbiome（IF:14.650）發(fā)表的 “Rhizosphere microorganisms can influence the timing of plant flowering”的文章，通過16S+代謝組學技術，發(fā)現(xiàn)根際微生物群對植物關鍵功能的調(diào)控發(fā)揮重要作用，揭示了擬南芥根部微生物將色氨酸轉(zhuǎn)化為植物激素吲哚乙酸從而延遲開花的代謝調(diào)控網(wǎng)絡和作用機制。

中文標題：植物根際微生物對開花時間影響的研究

材料：野生型和突變型擬南芥根系分泌物、根際土壤

影響因子：14.650

發(fā)表期刊：Microbiome

主要運用技術:?16S+代謝組學（鹿明生物提供技術支持）??

研究背景

研究表明，植物根際微生物群在植物的生長和繁殖中起著至關重要的作用。根際微生物群可以抵御病原體，通過產(chǎn)生植物激素來改善生長，并可以幫助植物抵御環(huán)境干擾，還可促進表型變化。

但是對植物微生物群、根系分泌物以及植物生長與繁殖之間的相互作用的理解仍然很有限。根系分泌物占光合固碳總量的5-21％，有助于促進形成植物根際微生物群落；也可能包含信號傳導和化學吸引分子，這些分子會吸引有益微生物聚集，有助于增強病原體抗性、蓄水性和促進生長激素的合成，并影響植物表型。

作者通過研究根系分泌物、土壤微生物和植物生理之間的相互關系，發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用具有影響根際群落動態(tài)變化的能力，并通過復雜的反饋機制改變植物表型的潛力。

研究思路

研究方法

1.?實驗材料準備及分組

從種子開始培養(yǎng)兩周的野生型Col-0（Wt）和pgr5突變體（光系統(tǒng)突變體）擬南芥幼苗，移植到混合土壤中進行盆栽種植，土壤來自浙江工業(yè)大學。種植條件為25±0.5℃、80％相對濕度、冷白色熒光燈（300μmol光子/ m2 / s）和光暗周期12：12-h。在花芽為1±0.1厘米時收集根際土壤，進行微生物代際實驗（共三代，圖1a），并記錄時間和生理參數(shù)。

2.檢測方法

（1）土壤微生物16S rRNA基因測序

（2）實時定量PCR（qRT-PCR）分析根際DNA豐度

（3）土壤樣品溶解相的測量

（4）根系分泌物GC-MS代謝組分析

（5）添加色氨酸（Trp）、5-羥色氨酸（5-HTP）和吲哚乙酸（IAA）并進行開花前后相關的基因轉(zhuǎn)錄組測序分析。

實驗結(jié)果和討論

1.根際微生物可延遲野生型擬南芥的開花時間

多代適應性/馴化實驗可用于觀察微生物介導的植物生長和繁殖機制。本實驗發(fā)現(xiàn)第3代Wt-M根際微生物群可顯著影響擬南芥開花和繁殖，G3-Wt-M組的開花時間明顯延遲了大約3天，并且角果數(shù)量顯著增加。但根際微生物的豐富度和多樣性隨著變化而趨于下降。與第1代根際相比，第2代和第3代微生物菌群中Proteobacteria和Acidobacteria相對豐度降低，而桿菌和藍細菌豐度有所提高（圖1c）。實驗結(jié)果表明，某些早（或晚）開花植物可能與特定的土壤微生物家族有關，而植物微生物群可能與不同植物生長階段的變化有關。本實驗中三代選擇富集的微生物在植物開花時間的調(diào)節(jié)起關鍵作用。

圖1?|跨代微生物實驗設計和根際微生物群落概況

（a）植物選擇土壤微生物的實驗操作圖；

（b）根際微生物豐富度：ACE指數(shù)和每個樣品的物種數(shù)；

（c）三代擬南芥中最豐富的10種微生物門的相對豐度。G-Wt-M代表相應野生型世代中的微生物群；G-pgr5-M代表相應世代pgr5擬南芥中的微生物群。

2.根際微生物可影響pgr5突變體擬南芥的開花時間

為了更好地了解微生物群，分泌物和開花時間之間的關系，作者使用了擬南芥突變體（PGR5基因）植株，pgr5突變體具有光合作用的缺陷，根際分泌物與野生型有所不同。微生物群處理組中的pgr5突變體，與對照組（不添加土壤微生物群）相比，在第3代微生物群的開花時間提前將近4天，并且角果數(shù)顯著降低。因為pgr5-M和Wt-M處理組的香農(nóng)多樣性和豐富度指數(shù)在三代中一般沒有差異，但是ACE數(shù)據(jù)在一代之后有所不同（圖1b）；在每個世代的兩個擬南芥品系之間，門的相對豐度僅略有不同（圖1c）。因此作者推斷由微生物引起的植物繁殖變化可能不是由根際多樣性導致的。

3.稀有根際微生物可能影響擬南芥的開花時間

第三代Wt培養(yǎng)的微生物群（WM）和第三代pgr5培養(yǎng)的微生物群（PM）處理組之間的豐度差異較大，WM和PM處理共有77個根際屬的相對豐度差異顯著。有41個屬在WM處理組中富集，而PM處理則有36個屬富集。大多數(shù)富集的根際微生物是稀有的（相對豐度<1％），表明稀有的根際微生物可能在擬南芥開花中起調(diào)節(jié)作用。

圖2 | 第三代微生物功能的驗證

野生型（Wt）和兩個突變體開始開花的天數(shù)（a，c）、新芽重（b，d）。

第三代未滅菌土壤泥漿（WM和PM）（a，b）或無菌土壤泥漿（WM-S和PM-S）（c，d）生長的擬南芥。

WM-第3代微生物菌群生長的野生型擬南芥；

PM-第3代微生物菌群生長的pgr5突變體擬南芥；

WM-S無菌土壤生長的野生型擬南芥；

PM-S無菌土壤泥漿生長的pgr5突變體擬南芥。

野生型和兩個突變株系（pnsB4和pgr5）擬南芥的土壤樣品中涉及氮循環(huán)基因的相對豐度（e: amoA，氨氧化;

?f: nifH，氮固定; g: nirK，亞硝酸還原酶; h: nosZ，一氧化二氮還原酶）

4.微生物功能的驗證

在Wt、pnsB4和pgr5突變體植株中，添加Wt菌群使開花分別延遲3.3、5.5和5.7天（圖2a）。與添加pgr5菌群相比，用Wt菌群處理的三個品系中植物的苗鮮重也顯著增加（圖2b）。這些結(jié)果清楚地表明開花時間可能受到根際菌群的影響。但在接種前對土壤漿液進行滅菌時，這種作用也消失了，表明僅有根系分泌物并不能調(diào)節(jié)擬南芥的開花時間（圖2c，d）。有趣的是WM和WM-S（滅菌土壤泥漿）處理過的植物之間的差異不是很明顯。原因可能是滅菌土壤漿中含有更多的氮和其他養(yǎng)分來影響開花時間，這與圖3中的結(jié)果一致。因此作者推測滅菌漿液中的代謝產(chǎn)物也影響開花時間和植物形態(tài)。多個證據(jù)表明，在pgr5處理組中通過根際微生物群調(diào)節(jié)氮循環(huán)和生物利用度導致氮缺乏，從而誘導較早開花。低濃度硝酸鹽可以誘發(fā)開花，但是在氮充足時，在開花前植物生長量最大。

圖3 | ?N可用性可能會受到第三代微生物群的影響

三個擬南芥品系在WM和PM處理組接種后（n = 12），（A）N含量（NH4+）；

（B）脲酶活性；

（C）N含量（NO3-）和（D）硝酸還原酶活性。

不同的字母代表顯著差異（p <0.05）。

?紅色符號代表經(jīng)WM處理的樣品，藍色符號代表經(jīng)PM處理的樣品。

5.兩個擬南芥品系中不同的根系分泌物

根系分泌物可以作為影響微生物組成的關鍵底物或信號分子，作者進行了品系之間不同濃度和組成分泌物的檢驗。GC-MS非靶向代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，兩條株系（Wt和pgr5）共有34種差異分泌物，涉及10條代謝途徑（圖4）。相對于pgr5，Wt中有4條條代謝途徑上調(diào)（圖4b）。胸腺嘧啶是差異最大的代謝物，可被細菌降解，可能是WM組中NH4+含量增加的原因（圖3A）。Wt培養(yǎng)物中氨基酸的濃度通常較高，可能與Wt培養(yǎng)物中枯草芽孢桿菌的豐度較高有關，其中氨基酸是趨化因子。在Wt培養(yǎng)物中色氨酸及其衍生物、酚和一些羧酸滲出量較高。這些代謝組學結(jié)果表明滲出液會影響根際微生物群。

圖4?| 兩種擬南芥株系的根系分泌物

（a）Wt和pgr5處理組根系分泌物（n = 6）的PCA得分圖；

（b）Wt和pgr5處理差異分泌物的相應代謝途徑（p <0.05）；

（c）第三代擬南芥Wt或pgr5突變體培養(yǎng)物土壤的色氨酸（Trp）和吲哚-3-乙酸（IAA）含量；

（d）預先在Wt擬南芥土壤培養(yǎng)并被添加到Wt（WM）或pgr5突變體（PM）擬南芥的微生物群中的Trp和IAA含量。

6.IAA通過下調(diào)開花相關基因來延遲開花時間

生長素以多種方式調(diào)節(jié)植物的生長，IAA是一種重要的植物生長素，具有調(diào)節(jié)花誘導信號的作用。微生物可以從Trp合成IAA，本實驗發(fā)現(xiàn)的根際富集微生物之一節(jié)桿菌具有產(chǎn)生IAA的能力，對植物生長有益。Wt分泌物中富含Trp及其衍生物，因此微生物產(chǎn)生的IAA可以通過新的分子網(wǎng)絡控制開花時間。土壤中Wt培養(yǎng)物產(chǎn)生的Trp含量降低，而IAA含量增加3.03倍，表明Wt菌群將Trp迅速轉(zhuǎn)化為IAA（圖4c，d）。作者通過向水培培養(yǎng)物中添加Trp、5-羥基色氨酸（5-HTP）和IAA并通過監(jiān)測開花時間來探索微生物產(chǎn)生IAA延遲開花時間的可能性，實驗表明IAA是延遲開花時間的直接驅(qū)動力。開花相關基因表達的變化進一步驗證了IAA在調(diào)節(jié)開花時間中的作用（圖5b）。

有文獻報道IAA減輕了天冬氨酸對花粉生長的抑制作用，因此推測IAA促進了擬南芥的生殖生長。本文進行的代際研究不僅證明IAA是延緩擬南芥開花的重要信號還第一次提出相關機制。早期的文獻研究表明，IAA可刺激花器官的發(fā)育，但延遲了擬南芥的開花時間。本文數(shù)據(jù)強烈表明IAA在沒有氮限制生長的情況下可延遲開花并充當了最佳生長條件的信號。

圖5 | IAA通過下調(diào)開花相關基因延遲開花時間

（a）抽薹比例；

（b）一代培養(yǎng)后，在開花早期、中期和后期擬南芥開花相關基因轉(zhuǎn)錄的相對速率（植物在含有5nM和25nM IAA的MS培養(yǎng)基中生長）。

研究結(jié)論

了解根際微生物的群落/功能關系以及與植物生理學相互作用對確定植物微生物組在調(diào)節(jié)生物地球化學循環(huán)、植物生長和物候?qū)W中的作用至關重要（圖6）。作者確定了一個新的代謝網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)分泌物影響植物的根際微生物群，然后通過產(chǎn)生IAA來調(diào)節(jié)開花時間，還可通過調(diào)節(jié)氮利用來影響營養(yǎng)生長。IAA促進植物生長也進一步刺激分泌物滲出，并因此以積極的反饋機制影響開花時間。

圖6 | 植物與根際微生物群之間相互作用的示意圖

假設的根際微生物群落-功能關系以及通過根系分泌物、氮循環(huán)和產(chǎn)生植物激素IAA與植物生理學和花卉物候?qū)W的相互作用

文末看點｜lumingbio

歐易/鹿明生物推出的16s+代謝組學的多層組學研究思路繼本篇文章前已先后助力了浙江工業(yè)大學、中國農(nóng)科院、青島農(nóng)業(yè)大學等在微生物一區(qū)頂刊Microbiome、醫(yī)學一區(qū)頂刊GUT發(fā)表文章。

歡迎百度搜索鹿明生物——訪問鹿明生物官網(wǎng)——了解更多16S、代謝組學技術

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