第二十一章：DNA重組及重組DNA技術(shù)

重組DNA技術(shù)：是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過程。

第一節(jié)：自然界的DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

一：同源重組是最基本的DNA重組方式

同源重組=基因重組：是指發(fā)生在同源序列間的重組，它通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。

二：位點特異性重組是發(fā)生在特異位點間的DNA整合

（一）入噬菌體DNA的整合

（二）細(xì)菌的位點特異性重組

（三）免疫球蛋白基因的重排

三：轉(zhuǎn)座重組可使基因移位

（一）插入序列轉(zhuǎn)座

（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座

四：原核細(xì)胞可通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組

（一）接合作用

（二）轉(zhuǎn)化作用

（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

第二節(jié)：重組DNA技術(shù)

重組DNA技術(shù)=分子克隆=DNA克隆=基因工程技術(shù)：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件連接，形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制，擴增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。

一：重組DNA技術(shù)中常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶=限制性內(nèi)切酶=限制酶=re：是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點并裂解磷酸二酯鍵

二：重組DNA技術(shù)中常用的載體

載體：是為攜帶目的外源DNA片段，實現(xiàn)外源DNA在受體細(xì)胞中的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

（一）克隆載體

1.克隆載體應(yīng)具備的基本特點

2.常用的克隆載體

質(zhì)粒，噬菌體DNA等

3.表達(dá)載體

1.原核表達(dá)載體

2.真核表達(dá)載體

三：重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟

（一）目的DNA的分離獲取-分

1.化學(xué)合成法

2.從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲取目的DNA

3.Pcr法

4.其他方法

（二）載體的選擇與構(gòu)建-選

（三）目的DNA與載體連接-接

1.黏端連接

2.平端連接

3.黏-平末端連接

（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞-轉(zhuǎn)

1.轉(zhuǎn)化

2.轉(zhuǎn)染

3.感染

（五）重組體的篩選-篩

1.借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選

2.序列特異性篩選

3.親和篩選法

（六）克隆基因的表達(dá)

1.原核表達(dá)體系

2.真核表達(dá)體系

第三節(jié)：重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

一：重組DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥

二：重組DNA技術(shù)還應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的其他諸多方面

第二十二章：基因結(jié)構(gòu)與功能分析技術(shù)

第一節(jié)：基因結(jié)構(gòu)分析技術(shù)

一：基因一級結(jié)構(gòu)解析技術(shù)

（一）雙脫氧法和化學(xué)降解法是兩種常規(guī)的DNA測序方法

（二）全自動激光熒光DNA測序技術(shù)的原理基于sanger雙脫氧法

1.四色熒光法

2.單色熒光法

（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷酸的測定技術(shù)

（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術(shù)

（五）單分子測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù)

二：基因轉(zhuǎn)錄起點分析技術(shù)

（一）用cDNA克隆直接測序法鑒定tss

Tss=基因的轉(zhuǎn)錄起點

（二）用5；-cDNA末端快速擴增技術(shù)鑒定tss

（三）用數(shù)據(jù)庫搜索tss

三：基因啟動子結(jié)構(gòu)分析技術(shù)

（一）用pcr結(jié)合測序技術(shù)分析啟動子結(jié)構(gòu)

（二）用核酸-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)分析啟動子結(jié)構(gòu)

1.用足跡法分析啟動子中潛在的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點

2.用電泳遷移率變動分析和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)鑒定啟動子

（三）用生物信息學(xué)預(yù)測啟動子

1.用啟動子數(shù)據(jù)庫和啟動子預(yù)算法定義啟動子

2.預(yù)測啟動子的其他結(jié)構(gòu)特征

四：基因編碼序列分析技術(shù)

（一）用cDNA文庫法分析基因編碼序列

（二）用rna剪接分析法確定基因編碼序列

（三）用數(shù)據(jù)庫分析基因編碼序列

五：基因拷貝數(shù)分析技術(shù)

第二節(jié)：基因表達(dá)產(chǎn)物分析技術(shù)

一：通過檢測rna而在轉(zhuǎn)錄水平分析基因表達(dá)

（一）用核酸雜交法檢測rna表達(dá)水平

1.用rna印跡分析rna表達(dá)

2.用核糖核酸酶保護(hù)實驗分析rna水平及其剪接情況

3.用原位雜交進(jìn)行rna區(qū)域定位

（二）用pcr技術(shù)檢測rna表達(dá)水平

1.用逆轉(zhuǎn)錄pcr進(jìn)行rna的半定量分析

2.用實時定量pcr進(jìn)行rna的定量分析

（三）用基因芯片和高通量測序技術(shù)分析rna表達(dá)水平

1.基因芯片已成為基因表達(dá)譜分析的常用方法

2.用循環(huán)芯片測序技術(shù)分析基因表達(dá)譜

二：通過檢測蛋白質(zhì)/多肽而在翻譯水平分析基因表達(dá)

（一）用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測蛋白質(zhì)/多肽

（二）用酶聯(lián)免疫吸附實驗分析蛋白質(zhì)/多肽

（三）用免疫組化實驗原位檢測組織/細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)/多肽

（四）用流式細(xì)胞儀分析表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽性細(xì)胞

（五）用蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳高通量分析蛋白質(zhì)/多肽表達(dá)水平

1.用蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)/多肽的表達(dá)譜

2.用雙向電泳分析蛋白質(zhì)/多肽表達(dá)譜

第三節(jié)：基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)

一：用功能獲得策略鑒定基因功能

（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能

（二）用基因敲入技術(shù)獲得基因的功能

二：用功能失活策略鑒定基因功能

（一）用基因翹楚技術(shù)使基因功能完全喪失

（二）用基因沉默技術(shù)可使基因功能部分缺失

1.用rna干擾技術(shù)研究基因功能

2.用mirna技術(shù)研究基因功能

3.用反義rna技術(shù)研究基因功能

4.核酶技術(shù)

三：用隨機突變篩選策略鑒定基因功能