第二十章：常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

第一節(jié)：分子雜交與印跡技術(shù)

分子雜交技術(shù)：利用DNA變性與復(fù)性這一基本性質(zhì)，結(jié)合印跡技術(shù)和探針技術(shù)，可進(jìn)行DNA和rna定性或定量分析。

（一）印跡技術(shù)

將瓊脂糖電泳分離的DNA片段在膠中變性使其變成單鏈，然后將硝酸纖維素膜放在膠上，將膠中的DNA轉(zhuǎn)移到nc膜上，使之成為固相化分子。將載有DNA單鏈分子的nc膜放在雜交反應(yīng)溶液中，溶液中具有互補(bǔ)序列的DNA或rna單鏈分子就可以結(jié)合到存在于nc膜上的DNA分子上。

（二）探針技術(shù)

探針：指的是帶有特殊可檢測標(biāo)記的核酸片段，它具有特定的序列，能夠與待測的核酸片段互補(bǔ)結(jié)合，因此可以用于檢測核酸樣品中存在的特定基因。

二：印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用

印跡技術(shù)可以分為DNA印跡、rna印跡和蛋白質(zhì)印跡三大類。

（一）DNA印跡

DNA印跡=southern印跡：dna樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將含有DNA區(qū)帶的凝膠在變性溶液中處理后，再將膠中的DNA分子轉(zhuǎn)移到nc膜上并使DNA固定在nc膜上，即可用于雜交反應(yīng)。DNA印跡技術(shù)主要用于基因組DNA的定性和定量分析。

步驟：

（二）rna印跡

Rna印跡=northern：其技術(shù)原理與DNA印跡相同，但rna分子較小，轉(zhuǎn)移前無需進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切割。Rna印跡技術(shù)主要用于檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mrna的表達(dá)水平，也可比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的表達(dá)情況。

（三）蛋白質(zhì)印跡

蛋白質(zhì)印跡=免疫印跡=western：先將混合蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到nc膜上，首先用第一抗體與轉(zhuǎn)移膜上相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，然后用堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體與之結(jié)合，反應(yīng)之后用放射自顯影來檢測蛋白質(zhì)區(qū)帶的信號，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)用于檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。

第二節(jié)：pcr技術(shù)的原理與應(yīng)用

一：pcr技術(shù)的工作原理

Pcr=聚合酶鏈反應(yīng)：以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，在引物和DNA聚合酶作用下，依半保留機(jī)制沿模板鏈延伸直至完成2條新鏈合成。重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。

反應(yīng)步驟：

1.變性：將反應(yīng)體系加熱至94度，使模板DNA完全變性稱為單鏈

2.退火：將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA結(jié)合

3.延伸：將溫度升至72度，DNA聚合酶以dntp為底物催化DNA的合成反應(yīng)。

上述三個步驟為一個循環(huán)，新合成的DNA分子繼續(xù)作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)后即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。

二：pcr技術(shù)的主要用途

（一）目的基因的克隆

（二）基因的體外突變

（三）DNA和rna的微量分析

（四）DNA序列測定

（五）基因突變分析

三：幾種重要的pcr衍生技術(shù)

（一）逆轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)

（二）原位pcr技術(shù)

（三）實(shí)時pcr技術(shù)

第三節(jié)：基因文庫

基因文庫：指的是一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆載體。基因文庫可分為基因組DNA文庫和cDNA文庫

一：基因組DNA文庫

基因組DNA文庫：以DNA片段的形式儲存著某一生物的全部基因組DNA信息。

二：cDNA文庫

cDNA文庫：包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mrna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存這該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。

第四節(jié)：生物芯片技術(shù)

一：基因芯片技術(shù)

基因芯片：是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律得緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測，比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。

二：蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片：將高度密集排列的蛋白質(zhì)分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白質(zhì)樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。

第五節(jié)：生物大分子相互作用研究技術(shù)

一：蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

（一）標(biāo)簽蛋白沉淀

（二）酵母雙雜交技術(shù)的原理和用途

二：DNA-蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)

（一）電泳遷移率變動分析

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)