北大藥學(xué)院

將非典型E3連接酶ZFP91促進(jìn)小分子誘導(dǎo)的

E2F2轉(zhuǎn)錄因子降解用于癌癥治療

轉(zhuǎn)錄因子E2 因子 (E2F) 家族是參與細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。作為E2F家族的重要成員，E2F2的異常表達(dá)總與各種癌癥的不良預(yù)后高度相關(guān)，例如，E2F2水平在晚期肝細(xì)胞癌中普遍上調(diào)，E2F2高表達(dá)的患者生存率普遍較低，這表明E2F2具有成為抗癌靶標(biāo)的潛在價(jià)值。因此，選擇性抑制E2F2功能的潛在治療策略的發(fā)現(xiàn)引起了廣泛關(guān)注。然而E2F2 作為轉(zhuǎn)錄因子，缺乏典型的配體結(jié)合域，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是“不可成藥”的靶點(diǎn)。分子膠是一類小分子，可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，以驅(qū)動(dòng)以前不可成藥的蛋白質(zhì)降解。但到目前為止，仍未見有關(guān)具有選擇性 E2F2 靶向特性的分子膠的報(bào)道。

為了探索 E2F2 降解策略，北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室屠鵬飛與曾克武團(tuán)隊(duì)使用中藥蟾酥主要活性蟾毒靈（Bufalin，BF）作為化學(xué)探針來確定其在肝細(xì)胞癌 (HCC) 中的藥理作用。結(jié)果表明，一種新的非典型E3連接酶ZFP91可作為降解E2F2轉(zhuǎn)錄因子的藥物靶點(diǎn)。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蟾毒靈具有分子膠的功能，可以有效誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子E2F2與非典型泛素連接酶ZFP91形成E2F2-ZFP91-蟾毒靈三聚體復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)E2F2的泛素化和蛋白酶體途徑降解。

此文章于2022年11月發(fā)表在eBioMedicin：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104353

MST微量熱泳動(dòng)技術(shù)

在這項(xiàng)研究中，NanoTemper的微量熱泳動(dòng)MST分子互作技術(shù)被用于檢測(cè)蟾毒靈作為分子膠水分別與E2F2和ZFP91的親和力（圖1）。

MST技術(shù)可以在細(xì)胞裂解液中檢測(cè)目的蛋白和另外分子的互作，即可免純化。對(duì)于難純化的蛋白來說，仍可完成定量親和力的檢測(cè)。

該研究中在裂解液中目的蛋白通過2種不同的方法帶上熒光，完成復(fù)雜環(huán)境中目的蛋白與其他分子的準(zhǔn)確親和力測(cè)定。

在檢測(cè)E2F2與蟾毒靈互作時(shí)，構(gòu)建了帶有his-tag標(biāo)簽E2F2質(zhì)粒，在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)。裂解后，使用NanoTemper RED Tris-NTA試劑盒特異性標(biāo)記裂解液中his-tag E2F2，使其帶上熒光，然后向裂解液中加入梯度稀釋的蟾毒靈。微量熱泳動(dòng) (MST) 實(shí)驗(yàn)表明，蟾毒靈直接與E2F2結(jié)合，解離常數(shù)為3.15 ± 1.43 μM（圖2）。

在檢測(cè)蟾毒靈與ZFP91互作時(shí)，作者構(gòu)建pEGFP-N1-ZFP91質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)，裂解后取上清，將上清液中的EGFP-ZFP91直接作為熒光信號(hào)源，加入梯度稀釋的蟾毒靈。MST測(cè)定顯示蟾毒靈以 462 ± 146 nM的解離常數(shù)（Kd）與ZFP91結(jié)合（圖3）。

蟾毒靈可拆分成α-吡喃酮（α-Pyr）與DHA兩個(gè)結(jié)構(gòu)，團(tuán)隊(duì)通過MST實(shí)驗(yàn)證明α-Pyr直接與ZFP91蛋白結(jié)合（Kd?= 900 ± 322 nM），但不與ZFP91的C349A突變結(jié)合（Kd未檢測(cè)到）（圖4），表明α-Pyr是蟾毒靈與ZFP91發(fā)生結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)。綜合其他結(jié)果，團(tuán)隊(duì)提出蟾毒靈可以作為分子膠介導(dǎo)E2F2-ZFP91復(fù)合物的形成，進(jìn)一步促進(jìn)E2F2的泛素化和降解。

總的來說，這項(xiàng)研究進(jìn)行了基于分子膠的E2F2癌癥治療靶向策略的概念驗(yàn)證，在癌癥治療中具有廣闊的藥用價(jià)值。同時(shí)，該研究還揭示了蟾毒靈作為天然“分子膠水”發(fā)揮抗腫瘤作用的獨(dú)特藥理機(jī)制，也為抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)提供了具有中醫(yī)藥特色的新穎靶點(diǎn)與先導(dǎo)藥物分子。

Monolith?分子互作儀

在此項(xiàng)研究中，MST技術(shù)為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-酶之間的親和力檢測(cè)提供了可靠的數(shù)據(jù)，并且可免純化定量檢測(cè)裂解液中目的蛋白和其他分子的互作強(qiáng)度，標(biāo)記方法靈活，大大加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。基于MST技術(shù)的Monolith系列分子互作儀，不依賴于分子量的改變，蛋白用量少，對(duì)于蛋白聚集耐受度高，可以輕松表征不同類型的分子間相互作用。

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