“透明”的道路——光透明技術(shù)與神經(jīng)科學
撰文丨之憫（華中科技大學 生物醫(yī)學工程博士）
責編丨高陽
排版丨小箱子
著名的恐怖電影《透明人》給不少人留下了深刻的印象，拋開科幻電影，現(xiàn)實中真的存在使生命體變透明的技術(shù)嗎？答案是肯定的，近年來發(fā)展出了能夠使離體組織和大小鼠全身透明的光透明技術(shù)，使科幻電影中的“透明”生物成為可能。光透明技術(shù)，顧名思義，就是通過多種物理化學手段，減小組織對光的散射，使不透明的生物組織變透明。該技術(shù)與熒光標記技術(shù)、光學成像技術(shù)結(jié)合，能夠獲取完整組織的三維整體結(jié)構(gòu)信息，這樣的技術(shù)是不是非常奇妙？
光透明技術(shù)是如何實現(xiàn)的？
光透明是如何讓生物組織透明的呢？要理解這個問題，就需要先知道組織為什么不透明。生物組織成分復雜，像蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和血紅素這些物質(zhì)，對光穿透組織非常不友好。光透明技術(shù)就是使用物理和化學手段將這些物質(zhì)除去，同時將組織浸泡在折射率匹配的高滲透高折射率的試劑中（圖1），通過這樣的處理，組織就會變得透明，給光穿透組織大開方便之門。
光透明技術(shù)簡介
現(xiàn)代光透明技術(shù)的研究，其實在很長一段時間內(nèi)處于停滯的狀態(tài)。人們對生命奧秘的探索隨著認知的加深越發(fā)的全面。從局部到整體，人們意識到三維成像的重要性，而這一迫切的需求使得光透明技術(shù)在近十年的時間內(nèi)呈現(xiàn)出井噴式發(fā)展。光透明技術(shù)的蓬勃發(fā)展如同春秋戰(zhàn)國時期的“百家爭鳴”，各種不同的透明試劑和方法提供給科研工作者多種選擇。光透明技術(shù)方法及所用試劑種類繁多，我們可以將其歸類為脂溶性光透明技術(shù)、水溶性試劑透明技術(shù)和水凝膠包埋透明技術(shù)。
脂溶性光透明技術(shù)從原理上來講，將脂溶性的試劑引入組織中，達到透明效果。一般而言，生物組織都含有大量的水分，需要先用“油水互融”試劑作為媒介，除去水分，然后再引入脂溶性的試劑。乙醇和有機試劑BABB就是最早選出來的“黃金搭檔”。水溶性光透明技術(shù)的發(fā)展充滿了偶然性和戲劇性。Miyawaki團隊將新生的小鼠胚胎放入尿素中，意外發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎完全透明了（圖2），據(jù)此該課題組建立了以尿素為基礎(chǔ)的Scale透明方法。后續(xù)根據(jù)尿素透明的原理，建立了一系列相關(guān)的水溶性試劑透明方法。水凝膠包埋透明技術(shù)也是采用去除脂質(zhì)達到組織透明，與尿素被動去除脂質(zhì)不同，該方法采用了新穎的生物材料——水凝膠（丙烯酰胺）作為組織固定和包埋的主要試劑，通過電泳主動除去脂質(zhì)。水凝膠單體酰胺結(jié)構(gòu)好像一只只小手，能夠緊緊抓住組織中蛋白質(zhì)的小尾巴（氨基末端），再通過單體直接的交聯(lián)形成一張緊密的“蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)”，把生物組織內(nèi)部的蛋白質(zhì)牢牢的粘在“蛛網(wǎng)”上。隨后通過電泳技術(shù)和強離子去污劑（SDS），像洗衣服一樣，將沒有黏在“蛛網(wǎng)”上的脂質(zhì)沖洗掉，以此達到透明效果。
光透明技術(shù)的應用
光透明的方法種類很多，目前約有二十余種，并且新的方法層出不窮，光透明技術(shù)仍在不斷發(fā)展和完善?；诠馔该鞣椒ǖ牟粩嘤楷F(xiàn)和發(fā)展，相關(guān)的應用研究也得以快速發(fā)展。
光透明技術(shù)廣泛應用于神經(jīng)環(huán)路的示蹤。神經(jīng)環(huán)路示蹤技術(shù)簡單來說就是使用特殊的病毒特異性感染神經(jīng)元，病毒經(jīng)過研究者的改造，能夠使被感染的神經(jīng)元帶有綠色或者紅色的熒光。通過這種顏色的顯示，我們能夠看到不同腦區(qū)神經(jīng)元及其纖維的投射情況，以及它們又是如何連接在一起的。以uDISCO（ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs）為例，聯(lián)合病毒示蹤技術(shù)可以幫助我們理解神秘莫測的神經(jīng)環(huán)路（圖3）。圖中綠色和紫紅色是被病毒（AAV-GFP/RFP）標記的皮層神經(jīng)元。我們能通過重建的三維圖，清晰看到皮層神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)纖維延伸到脊髓末端。像這樣長距離的投射在神經(jīng)系統(tǒng)里比較常見，如果采用傳統(tǒng)切片染色的方法，我們很難清晰直觀地看到如此長的神經(jīng)投射。而光透明技術(shù)的出現(xiàn)，就像將圖片變成動畫片一樣，可以呈現(xiàn)出一個生動活潑的影像。除應用于神經(jīng)環(huán)路研究，光透明方法也常用于觀察胚胎的發(fā)育過程。如圖4所示，利用光透明技術(shù)可觀察孕14.5天的胎鼠全身神經(jīng)絲，這樣色彩鮮亮美麗的三維圖，是不是很好地勾勒了胚胎發(fā)育的神奇和夢幻呢？
此外，光透明技術(shù)在心腦血管研究中也起到了重要的推動作用。腦外傷或腦血管病造成的神經(jīng)系統(tǒng)損傷對身體健康帶來極大影響，甚至會危及生命，是人們一直以來談虎色變的話題。以往由于方法的限制，多數(shù)研究都有“頭痛醫(yī)頭，腳痛醫(yī)腳”的局限，很少能夠觀察到模型動物的病理改變的全貌，對于其伴發(fā)外周癥狀的認識仍存在局限。vDISCO（nanobody(VHH)-boosted 3D imaging of solvent-cleared organs）技術(shù)的出現(xiàn)打破了這樣的僵局，該技術(shù)被美國國立精神衛(wèi)生研究所所長Thomas Insel評價為“這可能是幾十年來神經(jīng)解剖學最重要的進展之一”。vDISCO技術(shù)在對小鼠進行透明化處理后，利用納米抗體選擇性對特定的細胞類型進行標記。在不破壞機體結(jié)構(gòu)的情況下，不僅可以將小鼠體內(nèi)不同類型細胞的互作關(guān)系清晰準確地呈現(xiàn)出來，而且可以真正“透視”小鼠細胞、組織及器官的狀態(tài)以及之間的聯(lián)系。針對于腦損傷后引起或伴發(fā)肢體癥狀，研究者使用vDISCO透明技術(shù)，從腦損傷造模后的小鼠獲取了全身三維圖像，有助于直接觀察研究腦損傷后引起肢體動作不靈活的神經(jīng)機制。從圖5中我們能夠看到，與未經(jīng)受腦損傷的小鼠相比，腦損傷后小鼠上肢神經(jīng)叢數(shù)量明顯降低。這種全身透明技術(shù)，展示了病理狀態(tài)下，器官之間神秘的互相影響，為未來治療創(chuàng)傷性腦損傷提供新的思路。
綜上所述，處于不斷發(fā)展和完善的光透明技術(shù)，在神經(jīng)環(huán)路示蹤、胚胎發(fā)育以及神經(jīng)疾病研究中已經(jīng)有了較廣泛的應用。傳統(tǒng)透明化技術(shù)只能對軟組織進行處理，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已能夠同時實現(xiàn)軟組織和骨骼等硬組織的透明化處理，期待這一技術(shù)能夠得到進一步發(fā)展，并憑借其獨有的優(yōu)勢未來在腫瘤轉(zhuǎn)移、干細胞移植療效評估等領(lǐng)域得到更多應用，幫助我們更深入地探索機體生理及疾病的奧秘。
封面來源
Zhong Hua (Johns Hopkins School of Medicine)
https://www.nikonsmallworld.com/galleries/2013-photomicrography-competition
參考文獻
1.Chen, L., et al., UbasM: An effective balanced optical clearing method for intact biomedical imaging. Scientific Reports, 2017. 7: p. 12218.
2.Pan, C., et al., Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods, 2016. 13: p. 859-867
3.Zhu, J., et al., MACS: Rapid Aqueous Clearing System for 3D Mapping of Intact Organs. Advanced Science, 2020. 7: p. 1903185.
4.Cai, R., et al., Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience, 2019. 22: p. 317-327.
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