寫在前面

????????今天推薦的是由浙江大學(xué)生命科學(xué)研究所在2019年5月28日發(fā)表于The Journal of Clinical Investigation（2020IF：14.808，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Jin Jin教授，研究表明USP16介導(dǎo)的鈣調(diào)磷酸酶A去泛素化控制外周 T細胞穩(wěn)態(tài)維持。

研究背景

????????鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶作為一種鈣激活的磷酸酶，使各種底物去磷酸化，以觸發(fā)它們的核易位和轉(zhuǎn)錄活性。然而，調(diào)節(jié)NFAT募集到鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的詳細機制仍然知之甚少。

摘要部分

????????在這里，作者報告了由PPP3CB或PPP3CC編碼的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A(CNA)在賴氨酸327上組成性泛素化，并且該多泛素鏈被泛素羧基末端水解酶16(USP16)迅速去除以響應(yīng)細胞內(nèi)鈣刺激。CNA的K29連接泛素化會損害NFAT募集和NFAT靶向基因的轉(zhuǎn)錄。USP16缺乏以與外周T細胞的穩(wěn)態(tài)維持和增殖缺陷的方式阻止了鈣觸發(fā)的CNA去泛素化。T細胞特異性USP16敲除小鼠表現(xiàn)出自身免疫性腦炎和炎癥性腸病的嚴重程度降低。作者的數(shù)據(jù)揭示了CNA泛素化及其去泛素化酶USP16在外周T細胞中的生理功能。值得注意的是，作者的結(jié)果突出了調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的關(guān)鍵機制和治療自身免疫性疾病的新型免疫抑制藥物靶點。

研究內(nèi)容

1.非蛋白水解泛素化抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性和NFAT募集? ? ?

????????已知鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與 T細胞活化和鈣依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，指示鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶激活的詳細機制和修飾仍然知之甚少。有趣的是，作者的研究結(jié)果表明，在小鼠原代CD4+?T細胞中，CNA的催化亞基在TCR或PMA/離子霉素(P/I)刺激下迅速去泛素化，而蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化。一致地，從健康供體的外周血單核細胞(PBMC)獲得的人類CD4+?T細胞在P/I刺激5分鐘后表現(xiàn)出類似的CNA去泛素化。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是調(diào)節(jié)亞基CNB和催化亞基CNA的異二聚體，可由PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC中的任何一個編碼。在3CB中，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)?26-351位的氨基酸被刪除時，多泛素化水平顯著降低。這些結(jié)果表明潛在的泛素化位點位于殘基326-351。作者在該片段中僅鑒定了2個賴氨酸殘基K327和K332。為了確認CNA的泛素化位點，作者從原代CD4+?T細胞中分離了CNA，質(zhì)譜分析顯示K61和K327被泛素化。這些數(shù)據(jù)支持作者的結(jié)論，即泛素化是CNA避免其自動激活的關(guān)鍵過程。

????????為了進一步研究CNA在這些特定賴氨酸殘基上的功能意義，作者將賴氨酸殘基替換為精氨酸殘基(R)以生成CNA點突變體。K327R突變導(dǎo)致片段失去多泛素化能力。與從3CB獲得的發(fā)現(xiàn)一致，3CA或3CC在該保守賴氨酸殘基處的突變也導(dǎo)致泛素化水平降低。3CB的NMR結(jié)構(gòu)顯示K327位于疏水口袋內(nèi)，該口袋與NFAT的短線性基序(PxIxIT)結(jié)合。因此，作者假設(shè)CNA泛素化可能涉及其與底物的相互作用。共免疫沉淀(coIP)分析表明，CNA泛素化缺陷導(dǎo)致NFAT2募集增加。這些數(shù)據(jù)表明K327處的CNA去泛素化對于活化 T細胞中的NFAT募集至關(guān)重要。

研究結(jié)論：T細胞活化與鈣調(diào)磷酸酶A的去泛素化有關(guān)。

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2.USP16選擇性地與由PPP3CB和PPP3CC編碼的CNA相關(guān)聯(lián)? ? ?

????????為了確定調(diào)節(jié)CNA去泛素化的潛在DUB，作者篩選了CNA和HEK293 T細胞中46個單獨DUB之間的相互作用。coIP結(jié)果表明，只有異位USP16與內(nèi)源性CNA相關(guān)。如之前的研究所示，人類USP16中的半胱氨酸205是其催化活性所必需的。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T USP16，而不是催化失活的USP16 C205S突變體（USP16-CI）導(dǎo)致CD4+?T細胞中更高的P/I誘導(dǎo)的NFAT活性，如NFAT熒光素酶報告基因檢測所示。在沒有刺激的情況下，coIP結(jié)果顯示內(nèi)源性USP16和CNA之間沒有相互作用，而TCR連接迅速誘導(dǎo)USP16與CNA結(jié)合。通過共聚焦顯微鏡，作者發(fā)現(xiàn)在靜息CD4+?T細胞中，USP16主要位于細胞核中并與胞質(zhì)CNA分離。TCR刺激3小時后，在細胞質(zhì)中觀察到USP16與CNA的顯著共定位。作者首先證明USP16與PPP3CA無明顯關(guān)聯(lián)，隨后發(fā)現(xiàn)過表達的USP16與3CB或3CC在HEK293 T細胞的關(guān)聯(lián)。共聚焦圖像顯示，在沒有刺激的情況下，轉(zhuǎn)染的USP16主要分布在細胞質(zhì)中。所有這些數(shù)據(jù)表明，P/I或TCR觸發(fā)的USP16從細胞核到細胞質(zhì)的易位對于其在 T細胞活化過程中與CNA的結(jié)合是必不可少的。

????????USP16包含一個肽酶域和一個鋅指泛素結(jié)合域(Znf-Ubp)。使用HEK293 T細胞的co-IP結(jié)果顯示CNA和USP16之間的關(guān)聯(lián)依賴于CNA的催化域和USP16的肽酶域。作者還確定了5個連續(xù)的氨基酸,TMIEV，它們在3CB和3CC之間是保守的，但在3CA中不存在。如果刪除了這5個氨基酸，則在USP16和3CBΔ86-91之間沒有檢測到關(guān)聯(lián)。

研究結(jié)論：TCR參與觸發(fā)USP16在活化的T細胞中與3CB或3CC的選擇性結(jié)合。

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3.USP16選擇性去除了CNA的K29連接的多聚泛素鏈? ? ?

????????為了表征USP16的DUB活性，作者分析了在HEK293 T細胞中與USP16共轉(zhuǎn)染后CNA的泛素化水平。結(jié)果表明，USP16-WT而非USP16-CI可以去泛素化3CB和3CC。體外去泛素化分析還表明USP16介導(dǎo)的3CB去泛素化需要其DUB活性，因為USP16-CI突變體未能去泛素化3CB。作者進一步發(fā)現(xiàn)USP16從3CB中選擇性地去除了K29連接的多聚泛素鏈，相反地增加了K33和K63連接的泛素化。

????????為了進一步證實USP16在內(nèi)源性CNA去泛素化中的關(guān)鍵作用，作者生成了USP16fl小鼠，并將它們與Cd4-Cre小鼠雜交以敲除T細胞中的USP16。IB分析揭示了USP16-KO T細胞中USP16表達的缺陷。此外，TCR刺激不影響早期WT T細胞中USP16的蛋白質(zhì)水平。盡管未檢測到對CNA和CaM的蛋白質(zhì)水平產(chǎn)生影響，但USP16缺乏部分抑制了由TCR刺激觸發(fā)的CNA去泛素化。然后，作者用編碼WT或無催化活性形式的USP16的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染USP16缺陷型CD4+?T細胞。數(shù)據(jù)表明USP16-WT而非USP16-CI突變體可以促進TCR刺激期間CNA的去泛素化。

研究結(jié)論：USP16選擇性去除了CNA的K29連接的多聚泛素鏈。

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4.USP16介導(dǎo)的CNA去泛素化對于NFAT激活是必不可少的? ? ?

????????為了闡明USP16介導(dǎo)的CNA在活化 T細胞中去泛素化的潛在機制，作者首先評估了P/I或TCR誘導(dǎo)的關(guān)鍵信號事件。USP16缺陷型CD4+?T細胞顯示出相當(dāng)?shù)腗AP激酶磷酸化激活水平和典型NF-κB激活水平。隨后作者評估了原代CD4+?T細胞中的Ca2+通量。FACS分析表明USP16缺乏不會導(dǎo)致上游Ca2+通量受損。與先前的結(jié)果一致，USP16缺陷型CD4+?T細胞顯示出受TCR或P/I刺激的NFAT1和NFAT2的活化和核易位減少，這導(dǎo)致NFAT靶向細胞因子的誘導(dǎo)減少。

????????在重建的USP16缺陷型CD4+?T細胞中，USP16-WT而非USP16-CI挽救了NFAT2的缺陷激活?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明，在不影響其他關(guān)鍵信號級聯(lián)的情況下，USP16是激活NFAT所特別需要的。為了進一步證實USP16在調(diào)節(jié)NFAT激活中的作用，作者檢查了內(nèi)源性CNA與CaM或NFAT2的分子相互作用。USP16介導(dǎo)的CNA去泛素化對于其與CaM的相互作用是可有可無的。相反，USP16缺乏完全破壞了TCR觸發(fā)的NFAT2向CNA的募集。為了闡明CNA泛素化與NFAT2激活之間的聯(lián)系，作者用WT(3CB-WT)或K327R突變體3CB(3CB-M)表達構(gòu)建體重建了鼠T細胞系EL4，然后使用USP16特異性shRNA敲低USP16表達。與在USP16缺陷型CD4+?T細胞中觀察到的類似，USP16沉默抑制了NFAT2向3CB-WT而非3CB-M的募集。因此，USP16似乎是通過調(diào)節(jié)NFAT募集和激活來調(diào)節(jié)CNA活性的關(guān)鍵。

研究結(jié)論：USP16介導(dǎo)的CNA去泛素化對于NFAT激活是必不可少的。

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5.USP16缺乏導(dǎo)致外周T細胞穩(wěn)態(tài)維持受損

????????作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的重要調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)USP16主要分布在免疫組織。USP16的mRNA和蛋白質(zhì)水平分析還表明，USP16在不同的免疫細胞中均勻表達。然而，USP16-KO小鼠脾臟和外周淋巴結(jié)中的T細胞數(shù)量明顯減少，而CD4+與CD8+?T細胞的比例沒有變化。出乎意料的是，F(xiàn)ACS分析表明雙陰性（DN）、雙陽性（DP）和單陽性（SP）CD4+和CD8+胸腺細胞的比例相當(dāng)，這表明USP16不參與T胸腺中的細胞發(fā)育。為了闡明USP16對胸腺細胞和外周T細胞的差異調(diào)節(jié)，作者評估了這些組織中3CA、3CB和3CC的表達水平。這些酶的qPCR分析顯示3CA主要在胸腺細胞中表達，而3CC主要分布在脾臟或淋巴結(jié)的外周 T細胞中。因為3CA不結(jié)合USP16，USP16缺陷胸腺細胞在P/I刺激后表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)腘FAT2核水平。這些結(jié)果表明USP16僅用于維持外周T細胞，而不是胸腺細胞的發(fā)育。另一方面，作者發(fā)現(xiàn)USP16-KO小鼠的外周記憶 T細胞頻率顯著降低。為了進一步研究USP16在T細胞中的內(nèi)在作用，作者將USP16-KO小鼠（CD45.2+）和WT B6.SJL小鼠（CD45.1+）的BM細胞轉(zhuǎn)移到RAG1缺失的小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生了骨髓（BM）嵌合小鼠。兩個月后，F(xiàn)ACS分析顯示這些嵌合小鼠中CD45.1+和CD45.2+胸腺細胞的水平相當(dāng)，USP16缺陷型CD45.2+細胞在脾臟中產(chǎn)生的成熟T細胞比例顯著降低。總之，USP16通過細胞內(nèi)在機制介導(dǎo)外周 T細胞穩(wěn)態(tài)維持和體內(nèi)平衡。

研究結(jié)論：USP16缺乏導(dǎo)致外周T細胞穩(wěn)態(tài)維持受損。

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6.USP16對T細胞活化和增殖至關(guān)重要

????????為了闡明USP16在調(diào)節(jié)T細胞活化中的詳細機制，作者首先證明USP16對成熟T細胞從胸腺到外周器官是不需要的。眾所周知，外周T細胞通過TCR介導(dǎo)的細胞分裂進行自我更新。因此，作者評估了用針對CD3和CD28的激動性抗體刺激的初始WT和USP16缺陷型CD4+?T細胞的增殖能力。CFSE標(biāo)記的USP16缺陷T細胞未能增殖，如CFSE強度沒有降低所示。只有WT USP16恢復(fù)了USP16缺陷型CD4+?T細胞的增殖能力，表明USP16的催化活性對T細胞增殖至關(guān)重要。BrdU摻入分析表明，來自USP16-KO小鼠的外周 T細胞無法在體內(nèi)和體外進入細胞周期。與增殖缺陷一致，原代的USP16缺陷型CD4+?T細胞在體外完全無法極化為Th1和Th17細胞。一致地，USP16缺乏導(dǎo)致Th2極化受損，并表明USP16缺陷T細胞可能在免疫反應(yīng)期間失去其生理功能。作者之前的結(jié)果表明，USP16通過控制NFAT激活來調(diào)節(jié)T細胞增殖。因此，作者用NFAT2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重建了WT和USP16缺陷的T細胞， NFAT2顯著恢復(fù)了USP16缺陷T細胞的增殖能力至其WT控制水平。

?研究結(jié)論：USP16對T細胞活化和增殖至關(guān)重要。

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7.USP16缺乏可減輕T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病? ? ?

????????鑒于USP16在 T細胞介導(dǎo)的炎癥中的潛在重要性，作者首先分析了USP16在從健康個體或炎癥性腸病(IBD)患者收集的腸組織中的表達。在健康對照中，USP16主要存在于腸上皮細胞中。相反，炎癥條件引發(fā)結(jié)腸浸潤CD4+?T細胞中USP16表達的增加。然后作者評估了自身免疫性疾病患者PBMC中USP16的mRNA水平。IBD患者的USP16 mRNA水平明顯高于健康對照個體。? ? ?

????????目前的證據(jù)表明 T細胞對IBD的發(fā)病機制有重要貢獻。為了確認病理性T細胞中USP16的表達，作者接下來檢查了從健康供體或IBD患者的外周血中分離的CD4+?T細胞中USP16的mRNA水平。統(tǒng)計分析顯示，來自CD而非UC患者的CD4+?T細胞中USP16的表達增加。一致地，CD4+?T細胞中USP16 mRNA水平較高的患者具有顯著較高的CD活性指數(shù)。

????????為了評估USP16在炎癥性疾病中的體內(nèi)功能，作者通過轉(zhuǎn)移效應(yīng) T細胞建立了結(jié)腸炎模型。將來自USP16-KO小鼠的原代CD45RBhi?CD4+?T細胞轉(zhuǎn)移到RAG1–/–小鼠中，與對照相比，并沒有誘導(dǎo)體重減輕或炎癥引發(fā)的死亡。一致地，USP16缺陷 T細胞不會導(dǎo)致結(jié)腸長度縮短或上皮剝脫。在脾臟和腸系膜淋巴結(jié)(mLN)中也檢測到USP16缺陷T細胞的百分比降低。

?????????為了進一步檢查USP16在T細胞介導(dǎo)的炎癥中的作用，作者評估了USP16在其他自身免疫性疾病中的表達，包括多發(fā)性硬化癥(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。qPCR分析和公共數(shù)據(jù)集顯示，與健康供體相比，MS或SLE患者的CD3+?T細胞中USP16的表達更高。另一方面，采用自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的T細胞依賴性自身免疫疾病模型，作者發(fā)現(xiàn) USP16-KO小鼠表現(xiàn)出明顯延遲的EAE發(fā)作和中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤水平顯著降低。在脊髓中，USP16-KO小鼠在浸潤性T細胞方面表現(xiàn)出嚴重缺陷，并且骨髓細胞(CD11b+?CD45hi)中度增加。一致地，USP16缺陷T細胞在MOG肽的反應(yīng)中表現(xiàn)出嚴重缺陷，這導(dǎo)致WT T細胞的強烈增殖。此外，在用MOG肽刺激后，來自EAE的USP16-KO小鼠的外周 T細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子水平明顯降低。

?研究結(jié)論：這些結(jié)果表明USP16是成熟T細胞增殖和T細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病所必需的

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結(jié)論與討論

????????本研究數(shù)據(jù)表明，來自不同自身免疫性疾病患者的外周CD4+T細胞顯示出USP16的水平升高。作者進一步闡明USP16在活化的T細胞中作為CNA的DUB發(fā)揮作用，USP16的缺乏導(dǎo)致鈣神經(jīng)蛋白活性受損。在TCR刺激下， USP16被招募到CNA上，并選擇性地去除3CB和3CC上的K29連接的聚泛素鏈。T細胞特異性USP16基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴重的外周T細胞數(shù)量減少，同時自身免疫癥狀減弱。表明USP16可能成為治療T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的新的治療靶標(biāo)。

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Thank you!

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原文鏈接:https://www.jci.org/articles/view/123801