腫瘤分子分型 | Cell：揭秘東亞地區(qū)非吸煙人群肺腺癌的早期分子特征
腫瘤分子分型：通過NGS、蛋白質(zhì)組等組學技術(shù)，對腫瘤進行分子譜的系統(tǒng)描繪，并根據(jù)分子特征譜，進行腫瘤的精準分類及精準診療研究。
分子分型已成為國家精準醫(yī)療戰(zhàn)略的重點研究投入方向；也備受CNS頂刊雜志青睞。
為了幫助廣大臨床研究者了解腫瘤分子分型及診療研究的重大前沿進展，我們收集整理了近幾年來發(fā)表于Cell、Nature、Cancer Cell等頂刊上的，基于蛋白質(zhì)組及蛋白基因組的腫瘤分子分型相關(guān)研究論文。
【腫瘤分子分型專輯】為大家精細解讀重磅研究與進展。
Proteogenomics of Non-SMoking Lung Cancer in East Asia Delineates Molecular Signatures of Pathogenesis and Progression
【癌種】：肺癌
【細分癌種】：非吸煙-肺腺癌
【地域】：中國臺灣
【通訊單位】：中央研究院化學研究所（中國臺灣，臺北）
【發(fā)表時間】：2020年
【涉及組學】：全外顯子、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、磷酸化修飾組
【文獻出處】：DOI:?https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.012
主要成果：
1. 東亞地區(qū)第一個非吸煙肺腺癌的深層蛋白質(zhì)組學景觀
2. 確定了年齡、性別相關(guān)的內(nèi)源性和環(huán)境致癌物誘變過程
3. 蛋白質(zhì)組信息分類可在早期階段區(qū)分出臨床特征
4. 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)確定腫瘤發(fā)生的重要特征、生物標志物和用藥靶點
疾病背景：
【流行病學】：肺癌是全球最常見的惡性腫瘤和癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病主要歸因于直接的煙草暴露。然而在全球，從未吸煙者的發(fā)病率仍然是一個嚴重的健康問題，尤其是在東亞女性當中。在英國大約10%-15%的肺癌患者會出現(xiàn)在從不吸煙的人群中；但在東亞，非吸煙人群中肺癌的發(fā)病比例會增加（尤其是女性）。在臺灣人群中，從不吸煙患者占主導地位（53％），特別是女性（93％）。此外，早期發(fā)病是東亞肺腺癌（LUAD）的明顯特征，特別是在從不吸煙者中。全球約有20％的I期患者在手術(shù)切除后仍復(fù)發(fā)。
【主要驅(qū)動基因】：EGFR
研究設(shè)計：
【主要樣本】：LUAD病人經(jīng)手術(shù)切除的癌 VS 癌旁組織
【樣本狀態(tài)】：新鮮冰凍
【樣本數(shù)量】：103 paired
【治療干預(yù)】：手術(shù)前未經(jīng)放化療等干預(yù)
【主要研究路線與內(nèi)容】：
1. 單組學分析：
組別：癌 VS 癌旁，42% 男性、58%女性、 83%非吸煙者
WES：基因拷貝數(shù)、基因突變；與TCGA隊列比較
TMT蛋白組 & MRM靶向蛋白組：蛋白鑒定與定量數(shù)量；蛋白組與mRNA相關(guān)性分析
TMT磷酸化蛋白組：修飾蛋白、修飾肽段鑒定與定量數(shù)量
2. 整合分析：
腫瘤的分子表達特征，及腫瘤發(fā)展過程中的動態(tài)演進：
1.mRNA-蛋白水平的表達與關(guān)聯(lián)?
2.NSCLC相關(guān)通路的蛋白-磷酸化調(diào)控分析?
3.腫瘤進展的分子動態(tài)
蛋白基因組分析：基因突變與mRNA/蛋白/磷酸化的表達關(guān)聯(lián)
1. 蛋白水平上的序列突變
2. EGFR突變與MAPK活性?
3. TP53突變相關(guān)分析
內(nèi)外致突變因素對突變譜及蛋白水平的影響：
1. 內(nèi)外因素相關(guān)的突變特征分析?
2. APOBEC特征性突變分析?
3. APOBEC特征性突變在蛋白與磷酸化層面的傳遞?
4. 內(nèi)外環(huán)境因素與腫瘤新生抗原負荷?
5. 受環(huán)境因素誘變的染色體區(qū)域分布?
6. 致癌標志物富集對細胞功能的影響
分子分型：
1. 基于蛋白質(zhì)組的分子分型與分子特征
2. 亞型1的疾病進程細分?
3. 亞型的EGFR-L858R特征與生存期?
4. 亞型相關(guān)的潛在標志物與藥靶
基于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)特征，識別蛋白質(zhì)組亞型的候選標志物和藥物靶點：
1. 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建?
2. 亞型的網(wǎng)絡(luò)特征?
3. 基于網(wǎng)絡(luò)的潛在標志物與藥靶
主要研究結(jié)果：
一、多種組學檢測結(jié)果的統(tǒng)計
二、基因突變情況
1. 大多數(shù)肺癌腫瘤有EGFR突變(85%)，其次是TP53突變(33%)和RBM10(20%)突變。與TCGA不同，C> T轉(zhuǎn)化是臺灣（以下簡稱TW）人群中最常見的。
B． ?The percentages of SNVs in the TCGA cohort
2.值得注意的是，RBM10和EGFR-L858R突變在女性中較頻繁，而KRAS和APC則經(jīng)常在男性中突變。KRAS和ATM是吸煙歷史患者的顯著突變。RBM10突變在老年女性中更為普遍。與其他隊列比較，EGFR和RBM10以及兩個細胞周期相關(guān)基因（CDC27和RB1）在本隊列中具有更高的突變頻率，而TP53、KRAS和KEAP1的突變在其他研究中更為普遍。
(D) Clustergrams of mutually exclusive mutated genes.
(E) Correlation plot of the mutation frequencies observed in the Taiwan cohort compared to previously published cohorts.
(F) Bar plots of mutational frequencies for genes with significant difference beTWeen the Taiwan cohort and previously published LUAD studies.
結(jié)論：鑒定了東亞人群非吸煙肺腺癌患者的主要突變基因及其特征，與先前的研究（主要包括吸煙者）存在顯著差異。在不吸煙的人群中，排名最高的基因的突變頻率也明顯不同，這表明TW和TCGA LUAD人群之間的驅(qū)動因素顯著不相同。
三、腫瘤的轉(zhuǎn)錄、蛋白、磷酸化的分子表達特征，及腫瘤發(fā)展過程中的動態(tài)演進
1. 轉(zhuǎn)錄-蛋白相關(guān)性分析：
（1）整體樣本水平上：主成分分析（PCA）顯示，在RNA和蛋白質(zhì)水平，腫瘤和正常組織均清晰分離；與正常組織相比，腫瘤的變異更大；
（2）表達相關(guān)性分析表明：mRNA與蛋白在樣本維度的Spearman相關(guān)性中值為0.31，基因表達維度的Spearman相關(guān)性中值為0.14；僅22％的蛋白質(zhì)顯示與同源RNA的顯著正相關(guān)；
（3）通路功能方面：蛋白與mRNA具有一定的通路相關(guān)性，但在基礎(chǔ)細胞功能方面的相關(guān)性較低；DNA復(fù)制、糖酵解、谷胱甘肽代謝和免疫相關(guān)途徑在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)；而DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)加工和運輸途徑以及細胞粘附相關(guān)途徑的下調(diào)，在蛋白質(zhì)水平上更為明顯。
(E) KEGG pathway enrichment analysis using the median log2T/N values of proteins (Benj. Hoch. FDR < 0.05)
2.NSCLC相關(guān)通路的蛋白-磷酸化調(diào)控分析：大多數(shù)蛋白質(zhì)及其磷酸化位點受到差異調(diào)控，一些蛋白的表達水平下調(diào)，但磷酸化修飾水平卻上調(diào)。Raf/MEK/ERK軸上的磷酸化位點在患者間表現(xiàn)出很高的變異性，這表明MAPK通路的調(diào)節(jié)因患者而異。
3.? 腫瘤進展的分子動態(tài)
為了研究腫瘤進展的動態(tài)過程，按照將患者分為三個不同的分期組：IA期、IB期和RII期，并使用方差分析在蛋白質(zhì)和RNA水平進行差異表達分析 ，并采用k-均值聚類進一步將差異表達的蛋白質(zhì)和RNA分成兩個簇 。對階段性上調(diào)或下調(diào)的簇進行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)：在細胞間通訊、信號和質(zhì)膜中起作用的蛋白質(zhì)，如整合素、G蛋白偶聯(lián)受體、離子通道、獲得性免疫和抗原遞呈，在進展過程中呈現(xiàn)總體負調(diào)控趨勢；糖酵解、DNA復(fù)制、應(yīng)激反應(yīng)以及蛋白質(zhì)加工周轉(zhuǎn)和運輸過程中的蛋白質(zhì)在后期上調(diào)；另外DNA復(fù)制和修復(fù)過程的上調(diào)以及纖毛組裝基因的丟失在RNA水平上最為突出。
(I and J) Scatterplot of significantly enriched UniProt keyword and Gene Ontology annotations with up- and downregulation trend based on their median abundance per pathology stage at (I) protein level and (J) RNA level
結(jié)論：細胞向更晚期癌癥階段的轉(zhuǎn)化的特征是：復(fù)制過程中RNA到蛋白質(zhì)的整體活化，以及參與質(zhì)膜信號傳導和通訊的蛋白質(zhì)組學成分的負調(diào)控。此外，蛋白質(zhì)組學和RNA特征代表了腫瘤發(fā)展過程中發(fā)生的生物過程重塑特點，多組學整合對于識別腫瘤進展過程中分子穩(wěn)態(tài)失調(diào)非常重要性。
四、LUAD的蛋白基因組分析：基因突變與mRNA/蛋白/磷酸化的表達關(guān)聯(lián)：
1.??在蛋白水平上的突變：鑒定到319個蛋白的337個突變的肽段。
（1）其中驅(qū)動基因15個，包括：TP53BP1D358E、RNF213E1272Q、D1331G和KRASG12C等；
（2）RBM10的截短突變對RNA和蛋白質(zhì)水平有負調(diào)控作用，而KRAS，LABM1和PIK3CA錯義突變僅與蛋白表達增加相關(guān)。
2.EGFR突變與MAPK活性變化：（1）EGFR 的突變 (L858R and Del19)對蛋白表達水平的作用不一，但與蛋白磷酸化增加有關(guān)。EGFRpY1197與MAP2K2-pT394、MAPK3-pT198/pT202表達一致，進而與pMAPK1及其他下游信號通路相關(guān)磷酸化蛋白水平有關(guān)。
（2）即使在EGFR野生型中，也存在一定程度的MAPK活性。
（3）在EGFR野生型病例中，KRAS突變者表現(xiàn)出高MAPK活性。
（4）在腫瘤轉(zhuǎn)移期，MAPK表現(xiàn)出低活性。
(C) Scatterplots of co-phosphorylation within the EGFR-MEK-ERK axis (Spearman’s rank, p < 0.05).
(D) Ranked co-phosphorylation signature of the MAPK cascade aligned with clinical features.
3. TP53突變：TP53基因座是eQTL和pQTL熱點區(qū)域。（1）TP53突變與細胞周期基因有強正相關(guān)，其中包括來自微染色體維持復(fù)合物（MCM）和TOP2A的6個亞基，提示TP53-TOP2A可能具有協(xié)同致死效應(yīng)；（2）TP53突變與KIT致癌基因負相關(guān)；（3）TP53與參與DNA縮合和重組的蛋白質(zhì)和DNA損傷蛋白的較高磷酸化呈正相關(guān)。
(E) TWo-dimensinal plot representing eQTLs and pQTLs with variants (x axis) and associated genes (y axis). The size of the points is increasing with the confidence of the association
(G) Scatterplot of the MAPK pathway score and KIT relative abundance across patients
(H) Heatmap of phosphosites related to DNA condensation, recombination, and DNA damage response proteins positively associated with TP53 mutations.
結(jié)論：進一步揭示了基因組特征如何協(xié)調(diào)LUAD中的蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組。研究結(jié)果顯示MAPK級聯(lián)內(nèi)的蛋白質(zhì)磷酸化協(xié)同作用由EGFR和KRAS突變正調(diào)控，并且與腫瘤分期和TP53突變負相關(guān)。TP53突變與細胞周期基因、參與DNA拓撲調(diào)控和DNA損傷反應(yīng)的磷酸蛋白呈正相關(guān)，這與已知的合成致死相互作用是一致的。這些發(fā)現(xiàn)可能為后續(xù)相關(guān)研究及藥物干預(yù)策略提供依據(jù)。
五、內(nèi)外致突變因素對突變譜及蛋白水平的影響：
1.?突變特征分析：NMF（非負矩陣）法分析突變的三核苷酸序列基序的頻率，確認了５個突變譜，并采用余弦相似性分析揭示內(nèi)源性和外源性誘變劑在突變中的作用。
（1）與TW隊列最匹配的突變特征是：5-甲基胞嘧啶的脫氨、APOBEC胞嘧啶脫氨酶、煙草誘變劑暴露，以及二苯并[a,j]吖啶（DBAC）；此外還映射到烷基化劑二甲基肼（DMH），模擬太陽輻射（SSR）以及1,8-二硝基芘（1,8-DNP）誘變的特征；
（2）TCGA隊列的三個突變譜匹配到了APOBEC和煙草COSMIC特征，以及二苯并蒽(DBA)、DMH和SSR的特征
（3）與TCGA隊列相比，亞硝胺和硝基多環(huán)芳烴的特征僅在TW LUAD中顯著，這與亞洲地區(qū)這兩類致癌物的高暴露的流行病學證據(jù)一致。
2.?APOBEC特征性突變分析
C>T轉(zhuǎn)換的高比例與APOBEC突變特征有關(guān)，因此該研究重點關(guān)注了APOBEC特征性突變，并根據(jù)富集度評分將隊列分為：高APOBEC突變特征組與低APOBEC突變特征組。
（1）44%的患者有較高的APOBEC突變特征，且女性(57%)高于男性(25%)；
（2）高APOBEC突變特征和野生型 EGFR的女性患者比低APOBEC突變標簽和EGFR激活突變的女性患者更年輕，平均年齡分別為52.9歲和66.3歲。具體而言：高APOBEC突變標簽主要集中在74%的年輕女性（<60歲）和所有沒有EGFR突變的女性中，而在男性患者中沒有觀察到類似的趨勢；
（3）TCGA隊列的生存分析表明，在所有患者、所有女性和沒有EGFR激活突變的女性中，低APOBEC突變標簽與總生存期延長有關(guān)。
（4）高APOBEC突變標簽與接受聯(lián)合免疫治療(PD-1和CTLA-4)的晚期NSCLC隊列的無進展生存期略有延長有關(guān)。同時與WT患者相比，EGFR或ALK突變患者的反應(yīng)較差，這表明EGFR-WT患者是更好的免疫治療對象。
3. APOBEC特征性突變在蛋白水平與磷酸化水平的傳遞
（1）蛋白質(zhì)水平突變：在至少30%的患者中發(fā)現(xiàn)了APOBEC突變有關(guān)的APOBEC3家族的6個成員，且在女性患者中上調(diào)的更為顯著，其中APOBEC3F和APOBEC3G的性別差異最顯著(p<0.05)；
(B) Expression comparison of APOBEC family at mRNA and protein levels in female and male patients (Welch’s t-test and pairwise comparison, p < 0.05)
（2）通路相關(guān)分析：在高APOBEC突變標簽的女性患者的腫瘤中，參與DNA修復(fù)和復(fù)制的蛋白更為豐富，且這些蛋白的相對log2T/N值與APOBEC3成員呈正相關(guān)，特別是與3B、3D、3F和3G；
（3）激酶相關(guān)分析：激酶富集分析確定AurB、CK2、CDK1和CDK2是高APOBEC突變標簽女性患者組中最高激活的激酶，為具有高APOBEC突變標簽的女性患者提供了可行的干預(yù)候選方案。
篇幅較長，詳細請見下一篇~
