2023年1月12日，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院陸雪官、蘇鋒濤、嵇慶海教授團(tuán)隊(duì)在Cancer Immunology Research（IF:12.020）在線發(fā)表了題為“CD161 characterizes an inflamed subset of cytotoxic T lymphocytes associated with prolonged survival in human papillomavirus-driven oropharyngeal cancer”的研究論文。該研究不僅提供了對(duì)人乳頭瘤病毒驅(qū)動(dòng)的口咽癌免疫景觀的深入了解，而且還闡明了具有預(yù)后和治療意義的特殊細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞。

期刊：Cancer Immunology Research

影響因子：12.020

發(fā)表年月：2023年1月12日

方法：10x Genomics單細(xì)胞3端測序

研究背景

高危人乳頭瘤病毒 (HPV) 的持續(xù)感染是導(dǎo)致頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (HNSCC) 惡性轉(zhuǎn)化的主要病因?？谘树[狀細(xì)胞癌 (OPSCC) 的發(fā)病率在過去十年中迅速增加，并已成為西方國家中最普遍的 HPV 驅(qū)動(dòng)的 HNSCC。盡管出現(xiàn)在相似的解剖位置，但病毒驅(qū)動(dòng)的 OPSCC 與煙草或酒精相關(guān)的 OPSCC 不同，并且具有獨(dú)特的生物學(xué)行為和臨床表現(xiàn)。

盡管對(duì) HPV 感染驅(qū)動(dòng)的腫瘤內(nèi)廣泛的 T 細(xì)胞反應(yīng)庫進(jìn)行了大量探索，但亞群異質(zhì)性的深層表型和功能研究的缺乏仍然突出表明迫切需要全面了解 HPV 驅(qū)動(dòng)的 OPSCC 的免疫景觀，這將有助于優(yōu)先考慮哪些分子或細(xì)胞類型作為治療靶點(diǎn)。

研究結(jié)果

Result1 HPV 陽性 OPSCC 的單細(xì)胞表型

作者通過對(duì)HPV陰性和陽性患者的OPSCC腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與 HPV 陰性患者的同質(zhì)cluster 0 不同，HPV 陽性 OPSCC 的 CTL 顯示出異質(zhì)性增加，并且可以進(jìn)一步細(xì)分為cluster 2、3、9（圖 1A 和 C）。在 HPV 陽性患者的 CTL 中發(fā)現(xiàn)了總共 50 個(gè)下調(diào)和 124 個(gè)上調(diào)的差異基因，top 5 GO biological processes表明 HPV 驅(qū)動(dòng)的 OPSCC 中干擾素相關(guān)的免疫反應(yīng)上調(diào)（圖 1E）。細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)分析還表明，來自cluster 2、3、9 的 CTL 與癌細(xì)胞cluster和其他 T 細(xì)胞cluster的相互作用更緊密（圖1F）。作者由此提出HPV 的持續(xù)感染影響細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)錄特征，隨后導(dǎo)致不同的免疫反應(yīng)。

圖1

Result2 HPV 感染重塑 T 細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的浸潤

鑒于 HPV 陽性 OPSCC 中 CTL 的異質(zhì)性，作者在cluster 2、3 和 9 之間進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄比較以推斷主要功能，通過生信分析發(fā)現(xiàn)屬于cluster 3 的細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的分化軌跡（圖 2A），它們過表達(dá)與細(xì)胞毒性有關(guān)的T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物（例如 HAVCR2 [Tim-3 基因]、PDCD1 [PD-1 基因]、ENTPD1 [CD39 基因]、CTLA4））與和刺激性細(xì)胞因子（例如 GZMB [granzyme B 基因]、IFNG [ IFNγ] 基因）（圖 2B）。已有文獻(xiàn)報(bào)道表達(dá) PD-1/PD-L1 的免疫細(xì)胞的 HPV 陽性患者具有理想的臨床療效，此外作者發(fā)現(xiàn) KLRB1 在 CTL 中高表達(dá)（圖 2H；HPV+ 中 38.5% 的 CTL 與 HPV- 中的 7.7%）并且CTL在cluster 3 中占比最多，其相應(yīng)的產(chǎn)物 CD161 區(qū)分了一個(gè)表現(xiàn)出與之一致矛盾特征的亞群。因此作者推測，一部分耗竭型T細(xì)胞可能能夠發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用。

圖2

Result3 CD161+ CTLs 在 HPV 驅(qū)動(dòng)的 OPSCC 患者中非常豐富

接下來作者利用已知數(shù)據(jù)庫（TCGA 數(shù)據(jù)庫、GSE171898 和 GSE113282）比較了HPV陰性和陽性樣本中 KLRB1 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并驗(yàn)證了 KLRB1 在 HPV 陽性樣本中的普遍上調(diào)。為了探索 HPV 感染與 CTL 表型之間的關(guān)聯(lián)，作者將HPV 陽性患者的 TIL 或 PBMC 與自體單核細(xì)胞共孵育 5 天后，發(fā)現(xiàn)暴露于病毒抗原后 CD161+?比例增加，表明 HPV16 感染對(duì) T 細(xì)胞表型的影響。此外，還發(fā)現(xiàn)在 HPV 陽性樣本中CD8+CD161+ T 細(xì)胞比例高于HPV陰性樣本（圖 3B），并且該亞群在腫瘤中的頻率高于外周血（圖 3C），這意味著CD161的表達(dá)與HPV感染有關(guān)。在接受化療后，在外周血中該細(xì)胞亞群同步下降，由此推測CD161 可能成為替代生物標(biāo)志物。同預(yù)期一樣，與 HPV 陰性樣本相比，HPV 陽性 OPSCC 更密集地被 CD161+ CTL 浸潤（圖 3E），并且 CD161 的表達(dá)與 CD8 的表達(dá)顯著相關(guān)（圖 3F）。

圖3

Result4 CD161表現(xiàn)出表型和功能上不同的 CTL 亞群

?KLRB1+ CTLs 和 KLRB1- CTLs 經(jīng)差異分析顯示 CXCL13、CTLA4、GZMB、ENTPD1、AKAP5 的表達(dá)增加， GZMK、KLRG1 和 JUNB 表達(dá)下調(diào)（圖 4A）。KLRB1+ CTL 亞群和cluster 3 中表達(dá)特征的相似性，表明 CD161 可能定義一個(gè)具有刺激性和抑制性分子共表達(dá)的亞群。數(shù)據(jù)表明KLRB1+ T 細(xì)胞簇中耗竭特征、組織駐留記憶 T 細(xì)胞特征和趨化因子/IFNγ 特征的分?jǐn)?shù)相對(duì)較高（圖 4B）。且在腫瘤或外周血 CD161+ CTL 中證實(shí)了TNFα、IFNγ 和granzyme B，以及checkpoint PD-1 和 CD39 表達(dá)升高 （圖 4C）。盡管這背后的機(jī)制仍不清楚，但在某種程度上，與 CD161-CTLs相比，CD161+ 確實(shí)區(qū)分了具有強(qiáng)烈反應(yīng)性的炎性T 細(xì)胞亞群。

作者發(fā)現(xiàn) CTL 表現(xiàn)出從早期效應(yīng)狀態(tài)到功能失調(diào)的 T 細(xì)胞狀態(tài)的連續(xù)進(jìn)展。CD161+ CTL 不是處于衰竭的末期，而是更像是一個(gè)過渡亞群，因?yàn)樗鼈兊姆磻?yīng)具有可塑性。CD161+ CTL 中immune checkpoints的高表達(dá)意味著它們可能成為檢查點(diǎn)抑制劑的靶點(diǎn)。因此，作者嘗試阻斷 PD-1、CD39 和 Tim-3，并評(píng)估 CTL 對(duì)治療的反應(yīng)，PD-1 和 CD39 的抑制增加了 CD161+ CTL 的細(xì)胞毒能力（圖 4D），而 Tim-3 阻斷沒有觀察到類似效果。在用抗 CD161 阻斷 72 小時(shí)后，在 CD161+ CTL 中發(fā)現(xiàn) IFNγ 呈升高的趨勢（圖 4E），表明阻斷 LLT1/CD161 軸有較高的抗腫瘤治療潛力。因此，CD161+ CTLs 高浸潤的患者可能表現(xiàn)出更熱的腫瘤微環(huán)境，并可能優(yōu)先受益于檢查點(diǎn)抑制劑。

圖4

Result5 CD161 + CTL 的浸潤與較好的治療反應(yīng)和延長生存期有關(guān)

首先測序隊(duì)列患者腫瘤標(biāo)本中評(píng)估治療前CD161+ CTL 的浸潤密度，然后根據(jù)細(xì)胞浸潤程度（低，<5%；中等，5-10%；高，>15%）對(duì)患者進(jìn)行分組，結(jié)果顯示CD161+ CTL表達(dá)更高的患者治療后療效更好（圖5A-D）。隨后，作者又在53個(gè)樣本的驗(yàn)證隊(duì)列中，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論，根據(jù) HPV 狀態(tài)對(duì)患者進(jìn)行分組，然后按 CTL 的浸潤密度排序，結(jié)果證實(shí)具有更高密度 CD161+ CTL 的患者預(yù)后更好，表明治療前腫瘤內(nèi) CD161+ CTLs 的百分比可以作為治療預(yù)測因子，與 HPV 狀態(tài)無關(guān)。

最后，作者在78 名有CD161 受體表達(dá)的 OPSCC 患者驗(yàn)證隊(duì)列中分析了他們的的臨床結(jié)果。與前人報(bào)道一致，CD8+ T 細(xì)胞浸潤較高的患者具有較高的無進(jìn)展生存期（PFS） 和總體生存期（OS），但在單獨(dú)的 CD161+ 中未發(fā)現(xiàn)（圖 6A）。而CD161+CD8+ CTLs浸潤較高的患者具有更高的 PFS 和 OS ，尤其是浸潤到上皮細(xì)胞中時(shí)（圖 6B）。所有這些發(fā)現(xiàn)都證實(shí)了，根據(jù) CTL 上 CD161 的表達(dá)可以識(shí)別患有免疫學(xué)“更熱”腫瘤的患者，作為一個(gè)可量化的參數(shù)，基于CD161 的預(yù)后分層可能可以區(qū)分哪些患者療效會(huì)更好，并且與 HPV 狀態(tài)無關(guān)。

圖5

圖6

文章總結(jié)

作者闡述了 HPV 陽性 OPSCC 患者的獨(dú)特免疫學(xué)特征，即 CD161 是具有強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的 CTL 亞群的Marker，炎性表型與更好的臨床結(jié)果相關(guān)，可以幫助選擇符合條件的患者進(jìn)行免疫治療。