植物原生質體解離過程中存在外界應激，會造成結果失真

目前，通過制備植物原生質體，利用單細胞技術來研究植物細胞之間異質性，已經被廣泛認可并應用，植物原生質體的制備技術也較為穩(wěn)定，但在原生質體制備過程中涉及機械離心，抽打混勻、解離溫度等，這些因素給原生質體造成了諸多外界刺激，可能引起原生質體的轉錄組在解離過程中發(fā)生較大變化，從而造成“解離偏好”，使測序結果具有“假陽性”。

轉錄抑制劑能有效解決解離結果假陽性問題

那么如何來解決實驗過程中由于人為因素導致的轉錄變化呢？提起轉錄組變化，首先我們想到的就是使用轉錄抑制劑，顧名思義，轉錄抑制劑可以通過特異性地與DNA鏈結合或改變RNA酶活性來抑制某些轉錄，現在市面上的轉錄抑制劑包括茴香霉素、雷公藤內酯、放線菌素、α-鵝膏覃堿、BMH-21等等，它們的作用原理如下：

目前已在動物組織單細胞測序中有所應用，那么能不能把轉錄抑制劑也應用于植物原生質體解離及測序中呢？雖然植物和動物都是生物組織，但在物種生理特性、理化特性上都有極大的差異，適用于動物細胞的方法并不一定能簡單適用于植物原生質體?；谶@種想法及想解決問題的決心，我們決定突破它！

成果初顯：轉錄抑制劑的添加對植物原生質體解離效果未產生明顯影響

我們以擬南芥葉片作為目標材料，對照組按照正常解離流程進行，實驗組在解離過程中加入轉錄抑制劑。實驗結果如下圖所示，對照組（如圖A）和實驗組（如圖B）解離出的原生質體均可達到單細胞測序要求，說明加入轉錄抑制劑對解離后原生質體的解離效果不會產生影響，可以進行后續(xù)處理分析。

圖A：對照組擬南芥葉片原生質體分離鏡檢圖。

圖B：實驗組擬南芥葉片原生質體分離鏡檢圖。

轉錄抑制劑可有效抑制由外界刺激導致的原生質體的轉錄組變化

經單細胞測序及生信分析顯示，對照組較實驗組的應激基因表達有明顯的升高，而代謝類的基因表達有明顯的降低（表1），說明在解離原生質體的過程中添加轉錄抑制劑，可以抑制由外界刺激導致的原生質體的轉錄組變化。

圖C：對照組擬南芥葉片原生質體單細胞測序細胞聚類圖。

圖D：實驗組擬南芥葉片原生質體單細胞測序細胞聚類圖。

表1：對照組VS實驗組表達上調及下調的應激基因

差異基因分析也證明轉錄抑制劑的添加可以保證測序結果真實穩(wěn)定

對兩組進行差異基因分析發(fā)現對照組與實驗組比較共鑒定出349個上調基因，表達差異較大的前25個基因均為與應激機制相關的應激基因，鑒定出422個下調基因，表達差異較大的前25個基因均為代謝相關基因，說明在解離過程中加入轉錄抑制劑進行植物原生質體分離，可以有效抑制在解離過程由于人為及外界環(huán)境因素所導致的細胞轉錄組變化，從而保證測序結果真實穩(wěn)定。?

圖E：對照組與實驗組差異基因的表達情況熱圖

從以上實驗結果可知，在植物原生質體解離過程中添加轉錄抑制劑，能夠高效地從擬南芥組織中解離得到原生質體，并達到單細胞測序各項指標，且操作簡單，重復性高，實用性強，在后續(xù)的開發(fā)使用中具有極大的潛力。

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佳琦? 撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

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