質(zhì)粒是進行DNA重組的常用載體，在分子生物學(xué)實驗中經(jīng)常會用到。通常將目的基因插入到質(zhì)粒的多克隆位點上，構(gòu)建新的重組質(zhì)粒，目的基因即可以隨質(zhì)粒載體進入到受體細胞中。獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒對下游實驗起到非常重要的作用?，F(xiàn)在使用試劑盒提取質(zhì)粒已經(jīng)比較方便，菌體培養(yǎng)后可以多管濃縮提取，若提取到的質(zhì)粒較多，還可于-20℃保存用于后續(xù)實驗。

基礎(chǔ)知識：

1. 質(zhì)粒特性

質(zhì)粒是在細菌和其他細胞中發(fā)現(xiàn)的一種獨立于染色體外的小型環(huán)狀DNA 分子。質(zhì)?？梢蕾囁拗骷毎械拿负偷鞍踪|(zhì)進行獨立地復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；通常只攜帶少量基因，特別是一些與抗生素耐藥性有關(guān)的基因；可以在不同的細菌細胞之間傳遞。

按照質(zhì)粒的復(fù)制特性（可決定拷貝數(shù)），通常把質(zhì)粒分為兩類：（i）嚴緊型質(zhì)粒：染色體復(fù)制一次，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細菌內(nèi)只含1-2個質(zhì)粒；（ii）松弛型質(zhì)粒：細菌染色體復(fù)制停止后仍能繼續(xù)復(fù)制，每個細菌內(nèi)一般含20個左右質(zhì)粒拷貝。

2. 質(zhì)粒的分離純化

質(zhì)粒分離純化的過程實際上是將質(zhì)粒與染色體基因組、蛋白質(zhì)等其他成分分離的過程。盡管純化質(zhì)粒的試劑盒有多種，但其基本原理都相同：

首先，挑取菌落在含抗生素的適宜培養(yǎng)環(huán)境下生長。由于質(zhì)粒攜帶抗生素抗性基因，只有那些含有該種質(zhì)粒的細菌才能在這種培養(yǎng)液中生長。

接著，收獲細菌并在高pH條件下進行裂解。

然后，中和pH并加鹽。由于DNA是一種很強的陰離子，會通過陽離子鹽橋和帶負電的硅膠柱結(jié)合；而其他物質(zhì)，譬如蛋白質(zhì)，會隨著高鹽緩沖液通過硅膠柱而不被吸附。再向硅膠柱中加入低鹽緩沖液會破壞鹽橋，從而將質(zhì)粒DNA從硅膠柱中洗脫下來。

最后，離心去除碎片和基因組DNA。

實驗步驟：

1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

（i）將細菌置于LB培養(yǎng)基中37℃搖晃過夜后將菌種取出觀察活性（渾濁），然后將培養(yǎng)的菌種置于培養(yǎng)液中搖晃活化（使菌種處于對數(shù)生長期）；

（ii）高壓固體培養(yǎng)基并冷卻至合適溫度后，按質(zhì)粒說明書加入抗生素，待平皿凝固后蓋上平皿蓋，倒置平皿；

（iii）取出搖好活化的菌加入EP管4℃離心，吸出培養(yǎng)基后加入CaCl2制備感受態(tài)；

（iv）把制備好的裝有感受態(tài)細菌的EP管于冰上靜置，加入適當(dāng)質(zhì)粒后再次置于冰上靜置適宜時間，然后于適宜溫度熱激（打開孔道讓質(zhì)粒進入細菌）后再次插入冰內(nèi)靜置（關(guān)閉孔道避免進入細菌的質(zhì)粒離開細菌）一段時間，加入不含抗生素的LB慢搖（轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細菌表達出抗性蛋白使細菌耐對應(yīng)的抗生素）；

（v）將細菌接種至先前制備好的含有抗生素的平板上，倒置平板孵箱過夜（需設(shè)置對照——加入抗生素培養(yǎng)基的空白對照和加入未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒菌種的陰性對照）；

（vi）取出平皿觀察菌落生長情況，若樣品平板觀察到菌落且空白對照和陰性對照無菌落生長，實驗繼續(xù)（若空白對照和陰性對照觀察到菌落說明污染或抗生素?zé)o效；若樣品平板無菌落生長說明抗生素加入過多或轉(zhuǎn)化失?。?。

2. 搖菌培養(yǎng)

（i）將抗生素按說明書濃度加入 LB 培養(yǎng)基中，挑出樣品平板中得到的轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單個菌落，連槍頭一起打入；

（ii）37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。

3. 質(zhì)粒提取

3.1.?質(zhì)粒小提（初步驗證擴增的質(zhì)粒是否和原質(zhì)粒一致）

3.1.1 提取質(zhì)粒：用質(zhì)粒小提試劑盒按說明書要求提取質(zhì)粒。

3.1.2.?瓊脂糖凝膠電泳

（i）制備瓊脂糖凝膠：a）選擇足夠點樣口數(shù)量的塑料膠槽（點樣孔數(shù)量=樣品數(shù)量× 2+marker，需對比提出的樣品與原樣品是否相同）；b）配置好合適濃度的凝膠后迅速插上合適大小的梳子形成點樣孔；c）待膠完全凝固后小心拔出梳子；d）將凝膠置于電泳槽內(nèi)；

（ii）點樣：上樣前預(yù)電泳3~5 min，將核酸樣品與上樣緩沖液混合后點樣；

（iii）電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動，當(dāng)溴酚藍移動到距離膠板下沿約 1cm處時，停止電泳；

（iv）凝膠照相：將凝膠板置于紫外燈下進行照相，若大致分子量位置相同則質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

3.2. 質(zhì)粒大提：

（i）將搖菌培養(yǎng)和質(zhì)粒小提的剩余菌液混合，用質(zhì)粒大提試劑盒，按說明書要求提取質(zhì)粒；

（ii）瓊脂糖凝膠電泳確定質(zhì)粒質(zhì)量和濃度，將得到的質(zhì)粒稀釋成方便使用的濃度。

參考：

[1] 知乎-實驗室基礎(chǔ)：一文讀懂質(zhì)粒

[2] 知乎-【實驗視頻】質(zhì)粒的提取與純化

[3] 知乎-手把手教你完成質(zhì)粒DNA提取實驗

[4] 知乎-干貨 | 確認過眼神，是要提質(zhì)粒的人

[5] 知乎-實驗室●基礎(chǔ)篇 你應(yīng)該知道的質(zhì)粒那些事兒

[6]?TOP實驗室秘籍：質(zhì)粒擴增及提純的步驟詳解?

[7] 知乎-分子生物學(xué)質(zhì)粒純化技術(shù)步驟過程詳解