實(shí)驗(yàn)名稱：高壓放大器在介電泳效應(yīng)的細(xì)胞分選研究中的應(yīng)用

　　研究方向：生物醫(yī)學(xué)

　　測試目的：

　　細(xì)胞分選在分析化學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著非常重要的應(yīng)用。在眾多的分選方法中，微流控分選方法以其響應(yīng)速度快、樣品需求少等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱門。微流控細(xì)胞分選法可分為被動分選法和主動分選法。被動分選法對待分選細(xì)胞的性質(zhì)無要求，且無需預(yù)標(biāo)記，對芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及加工要求較高，且容易出現(xiàn)過濾結(jié)構(gòu)被堵塞等問題。主動分選法分選效率高，但對待分選的細(xì)胞通常有特殊要求，且大多需要對樣品進(jìn)行預(yù)標(biāo)記等處理，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性。

　　結(jié)合被動分選法和主動分選法的優(yōu)點(diǎn)，本文提出一種基于微結(jié)構(gòu)過濾法和介電電泳效應(yīng)的新型細(xì)胞分選方法。該方法在一定程度上克服了單一分選方法的弊端，有望解決微結(jié)構(gòu)過濾法普遍存在的堵塞問題。具體實(shí)現(xiàn)方式是在微過濾結(jié)構(gòu)區(qū)域集成微電極，通過調(diào)節(jié)過濾結(jié)構(gòu)幾何參數(shù)和加載的交流信號參數(shù)，誘導(dǎo)形成可以驅(qū)動細(xì)胞往低場強(qiáng)區(qū)域運(yùn)動的負(fù)向介電電泳效應(yīng)，進(jìn)而避免待分選細(xì)胞在過濾孔區(qū)域的堵塞。

　　測試設(shè)備：ATA-2042高壓放大器、函數(shù)信號發(fā)生器、蠕動泵、筆記本電腦、科研級攝像頭、倒置熒光顯微鏡、單反相機(jī)等。

　　實(shí)驗(yàn)過程：

　　①樣品溶液配制

　　使用非生物類樣品和生物類樣品來驗(yàn)證所設(shè)計(jì)多級化分選微流控裝置。非生物類樣品選用37μm、16.3μm和9.7μm三種尺度不同的微粒混合而成，使用PBS緩沖液調(diào)節(jié)其濃度到104~105/mL水平；為防止微粒之間相互黏附以及微粒和芯片之間的黏附，在緩沖液內(nèi)加入0.1%v/v濃度的Tween20。實(shí)驗(yàn)中使用的PBS緩沖液濃度為1mM，即10%濃度的PBS緩沖液，其電導(dǎo)率為0.17S/m，較低的電導(dǎo)率可以在一定程度上減少實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的焦耳熱效應(yīng)，降低其對待分選的樣品活性的影響。

　　生物類樣品選擇了雨生紅球藻和片球藻的混合懸液。兩種藻類均培養(yǎng)于BG11培養(yǎng)基。取適量雨生紅球藻和片球藻混合在一起，細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至104~105/mL水平。需要注意的是，由于藻類密度較大，在初步的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其極易沉底，在進(jìn)樣口處形成堆積，且在微流控芯片內(nèi)部流動性較差，因此在每毫升混合藻細(xì)胞懸液中加入0.4g山梨醇。

　?、趯?shí)驗(yàn)平臺搭建

　　圖：實(shí)驗(yàn)平臺

　　在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，要按實(shí)驗(yàn)需求搭建實(shí)驗(yàn)平臺。上圖所示所示為搭建好的實(shí)驗(yàn)平臺。芯片出口通過導(dǎo)管與蠕動泵相連接。蠕動泵向外抽取液體，在芯片內(nèi)形成負(fù)壓，以此驅(qū)動待分選微?；蛟寮?xì)胞的運(yùn)動。信號發(fā)生器與電壓放大器相連后通過導(dǎo)電膠布與ITO電極連通，為芯片提供所需激勵(lì)信號。實(shí)驗(yàn)過程的現(xiàn)象和數(shù)據(jù)采用單反相機(jī)與倒置顯微鏡相結(jié)合的觀測手段來獲取，實(shí)現(xiàn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)時(shí)觀察和記錄。

　　③芯片預(yù)處理

　　在注入實(shí)驗(yàn)樣本之前，需要對芯片進(jìn)行預(yù)處理。在微粒分選實(shí)驗(yàn)中，在芯片入口處加載不含微粒的10%PBS緩沖液；在藻細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)中，在芯片入口處加載不含細(xì)胞的BG11培養(yǎng)液。在芯片毛細(xì)作用和親水性的共同作用下，緩沖液會快速充滿整個(gè)芯片通道。打開蠕動泵，設(shè)置抽取速度為1mL/min，并抽取5分鐘。該步驟的目的是完全消除芯片內(nèi)的氣泡，防止氣泡影響微粒的運(yùn)動軌跡以及避免實(shí)驗(yàn)中氣泡可能造成的電極電解問題。

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　　使用移液器吸取50μL實(shí)驗(yàn)樣本，加載于芯片入口處。在蠕動泵誘導(dǎo)的負(fù)壓作用下，上述樣品會在微流控芯片內(nèi)向出口處流動。

　　⑤加載信號

　　開啟信號發(fā)生器和電壓放大器，加載交流信號于ITO電極上。調(diào)節(jié)信號頻率和幅值，優(yōu)化分選效率。

　　⑥實(shí)驗(yàn)記錄

　　打開單反相機(jī)，記錄實(shí)驗(yàn)過程。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

　　圖：37μm、16.3μm和9.7μm微粒的分選過程（A1-A4）第一級過濾級分選效果；（B1-B4）第二級過濾級分選效果

　　第一級過濾級分選情況如上圖A1~A4所示，16.3μm微粒和9.7μm微粒不斷的通過微柱間距為25μm的第一級，而37μm的微粒在介電電泳力的作用下，一直在過濾孔附近運(yùn)動，并沒有直接堵塞住過濾孔。當(dāng)微粒運(yùn)動到第一級過濾結(jié)構(gòu)（過濾孔大小為25μm）附近時(shí)，直徑37μm、16.3μm、9.7μm的三種微粒會呈現(xiàn)出不同的受力及運(yùn)動狀態(tài)：直徑37μm的微粒因大于過濾柱間的過濾孔尺度，必然不能通過該過濾級。該微粒在流向過濾孔的過程中，電場梯度不斷增大（兩微柱間過濾孔區(qū)域?yàn)樽畲箅妶鰪?qiáng)度梯度區(qū)域），所受負(fù)向介電電泳力nDEP也隨之增強(qiáng)，在曳力和nDEP作用下，微粒的運(yùn)動速度會降低，并繼續(xù)保持向過濾孔區(qū)域運(yùn)動。此時(shí)，微粒所受nDEP力進(jìn)一步增強(qiáng)，直至能夠抵消細(xì)胞所受的曳力，達(dá)到受力平衡態(tài)。但微粒會繼續(xù)在慣性作用下向過濾孔區(qū)域運(yùn)動，此時(shí)，在進(jìn)一步增強(qiáng)的nDEP效應(yīng)下，微粒會被反向推離過濾孔區(qū)域。上述過程會反復(fù)進(jìn)行，微粒會在此處呈現(xiàn)出振蕩狀態(tài)，運(yùn)動往復(fù)軌跡不斷減小，直至達(dá)到相對平衡狀態(tài)，從而在過濾孔區(qū)域形成聚集而不堵塞過濾孔的分布態(tài)勢，避免傳統(tǒng)微結(jié)構(gòu)過濾分選易出現(xiàn)過濾孔被微粒堵塞的情形發(fā)生。

　　第二級過濾級分選情況如上圖B1~B4展示，部分9.7μm到達(dá)過濾孔附近能夠立馬穿過過濾孔，其余9.7μm微粒會先在過濾孔附近聚集，然后連成串一起過去。當(dāng)16.3μm和9.7μm的微粒運(yùn)動到第二級過濾級附近時(shí)，由于第二級過濾級的過濾柱的結(jié)構(gòu)效應(yīng)，其電場梯度較第一級更強(qiáng)，直徑16.3μm的微粒形成的nDEP及曳力聯(lián)合作用下，使其呈現(xiàn)出與直徑37μm微粒在第一級過濾級相似的運(yùn)動狀態(tài)，在第二級過濾級的過濾孔區(qū)域呈現(xiàn)堆積而不堵塞過濾孔的分布。同時(shí)，因尺度效應(yīng)受nDEP較小的9.7μm的微粒流通過兩微柱間的過濾孔進(jìn)入后續(xù)結(jié)構(gòu)。

　　在不加載正弦激勵(lì)信號情況下，芯片很快就會因?yàn)檫^濾孔被堵塞而不能工作。本文在通過集成ITO微電極，借助負(fù)向介電電泳效應(yīng)較好地解決了傳統(tǒng)微結(jié)構(gòu)過濾法存在的堵塞問題，能夠在很大程度上改善芯片的分選通量。

　　安泰ATA-2042高壓放大器：

　　圖：ATA-2042高壓放大器指標(biāo)參數(shù)

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　　本文實(shí)驗(yàn)案例參考自知網(wǎng)論文《基于微結(jié)構(gòu)過濾和介電泳效應(yīng)的細(xì)胞分選微流控芯片及分選方法研究》

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