宿主誘導(dǎo)的基因沉默：一種針對(duì)鐮刀菌的有效控制策略

鐮刀菌屬Pezizomycotina由大約?300?個(gè)物種組成。某些物種，如禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、增殖鐮刀菌、茄病鐮刀菌和輪枝鐮刀菌是植物病原菌，可引起枯萎病或枯萎病。鐮刀菌產(chǎn)生霉菌毒素，對(duì)小麥、大麥和玉米具有特別的意義。對(duì)抗這些病原體的最新和有效的控制策略之一是基于通過宿主誘導(dǎo)的基因沉默（HIGS）對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行沉默。最近，一些研究人員成功地沉默了F. graminearum、F. oxysporum、F.culmorum和F. verticillioides中編碼細(xì)胞色素P450、幾丁質(zhì)合成酶、蛋白激酶等的重要基因，導(dǎo)致霉菌毒素產(chǎn)量減少。這篇綜述中，我們將介紹表明HIGS是控制植物中鐮刀菌屬感染的有力工具的報(bào)告。RNAi（RNA干擾）是指可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)基因沉默的生物過程。事實(shí)上，RNAi機(jī)制是植物對(duì)抗病毒病原體、真菌、細(xì)菌、害蟲和寄生線蟲的重要過程。在F. oxysporum、F. graminearum和F.culmorum中，通過雙鏈RNA（dsRNA）靶向真菌基因可導(dǎo)致真菌生長遲緩，和/或毒力下降，導(dǎo)致植物疾病癥狀減弱或病原體死亡。

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HIGS對(duì)抗F.graminearum

禾谷鐮刀菌在重要的谷類作物如小麥、玉米、大麥、黑麥、燕麥和三葉草中引起鐮刀菌頭斑?。‵HB），會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量和谷物質(zhì)量大幅下降。此外，該病原體在谷物中產(chǎn)生霉菌毒素，對(duì)動(dòng)物和人類有害。FHB主要是由F. graminearum引起的，其次是由F. culmorum、F.avenaceum、F. pseudograminearum、F. poae，有時(shí)由Microdochium引起，如M. nivale。在被感染的植物組織中，F(xiàn). graminearum產(chǎn)生三葉草毒素、DON以及衍生物、3-ADON、15-ADON（3-乙酰基DON和15-乙酰基DON）和nivalenol。一些國家已經(jīng)規(guī)定了谷物中鐮刀菌毒素的最大允許含量。由于目前的殺真菌劑效力有限，而且小麥和大麥缺乏主要的抗性基因，F(xiàn)HB的發(fā)生率正在增加。已經(jīng)探索了一些非常規(guī)的方法，使用先進(jìn)的生物技術(shù)來對(duì)抗FHB并盡量減少霉菌毒素的產(chǎn)生。其中，植物介導(dǎo)的FHB遺傳抗性是最有價(jià)值和成本效益的抗病策略。然而，最近的方法，如HIGS和SIGS，已經(jīng)成功地導(dǎo)致了基本真菌基因的沉默.?例如，F(xiàn). graminearum被HIGS控制，通過靶向真菌細(xì)胞色素P450 lanosterolC-14α-demethylase（CYP51）基因，這是麥角甾醇生物合成的必要基因，以限制真菌感染。F. graminicola的基因組中含有禾本科植物的基因組中含有三個(gè)真菌CYP51基因，即CYP51、CYP51A、CYP51B和CYP51C。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用CYP3RNA（一種791 bp的dsRNA構(gòu)建體，在體外條件下靶向CYP51A、CYP51B和CYP51C轉(zhuǎn)錄本）培養(yǎng)F. graminearum，導(dǎo)致生長受限，真菌形態(tài)改變，降低毒力（表1）。

此外，He等人（2019年）構(gòu)建了攜帶RNAi盒的轉(zhuǎn)基因Brachypodium distachyon品系，以針對(duì)兩個(gè)F. graminearum蛋白激酶基因Fg00677和Fg08731，以及CYP51編碼基因CYP51A，CYP51B，和CYP51C。所有相應(yīng)的獨(dú)立、Fg00677-RNAi、Fg08731-RNAi和CYP51-RNAi轉(zhuǎn)基因T2株系對(duì)F. graminearum表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性。結(jié)果表明，F(xiàn)g00677和Fg08731是HIGS的有效靶標(biāo)，可以應(yīng)用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因HIGS植物，以增強(qiáng)FHB的抗性。

植物病原真菌擁有多個(gè)幾丁質(zhì)合成酶（CHS）編碼基因，這些基因在真菌的發(fā)育和毒力方面起著關(guān)鍵作用。CHS基因也可以作為RNA沉默的靶基因來對(duì)抗鐮刀菌感染。Cheng等人（2015）采用HIGS靶向CHS基因，生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因小麥植株，以增強(qiáng)對(duì)鐮刀菌病原體的抵抗力，減少霉菌毒素。這些轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)了對(duì)F. graminearum的ChS3b基因有效的3種RNAi構(gòu)建體，對(duì)FHB和Fusarium苗期枯萎病（FSB）表現(xiàn)出持久和一致的抗性。這些結(jié)果證明了HIGS作為一種有效的策略在作物中產(chǎn)生環(huán)境友好和持久抗性的潛在效用。

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HIGS對(duì)抗F. oxysporum?

? ? ? ?F. oxysporum屬鐮刀菌屬，在土壤中無處不在。一個(gè)多世紀(jì)以來，這種病原體受到了極大的關(guān)注。F. oxysporum中獨(dú)特的formae speciales可以在150多個(gè)宿主中引起維管束枯萎病。農(nóng)藝實(shí)踐只能減少接種體的傳播，不能導(dǎo)致令人滿意的疾病控制效果。同樣地，土壤熏蒸和殺真菌劑的應(yīng)用都無法形成有效的疾病保護(hù)。有趣的是，Mumbanza et al.(2013)使用了一套合成的dsRNAs來對(duì)付引起香蕉鐮刀菌枯萎病的一些致病性鐮刀菌菌株，并證明了對(duì)香蕉鐮刀菌的強(qiáng)抗真菌活性。Ghag等人（2014）通過RNAi靶向Foc的重要基因，如velvet?和ftf1，以減少香蕉（Musa spp.）的鐮刀菌枯萎病。用這兩個(gè)基因的部分序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因香蕉在溫室條件下缺乏鐮刀菌枯萎病，即使在接種后8個(gè)月，對(duì)Foc的抗性也很明顯（表1）。在隨后的報(bào)告中（Hu等人，2015），HIGS被用來沉默F(xiàn). oxysporum f. sp. Conglutinans中的三個(gè)基因，F(xiàn)OW2、FRP1和OPR。接種到轉(zhuǎn)基因擬南芥品系上的F. oxysporum表現(xiàn)出三個(gè)目標(biāo)基因的mRNA水平大幅下降（平均75%、83%和72%）。所有轉(zhuǎn)基因品系對(duì)F. oxysporum表現(xiàn)出更高的抗性（表1）。Shanmugam等人（2017）報(bào)道了RNAi介導(dǎo)的致病性基因FOW2的沉默，一個(gè)ZnII 2Cys6型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器FOW2和V類CHS。通過RNAi證明了這兩個(gè)基因在F. oxysporum和F. solani的致病性中的作用。值得注意的是，HIGS介導(dǎo)的FOW2和ChSV的沉默導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)高毒力的維管束萎縮真菌菌株的抗性增強(qiáng).?使用靶向SGE1的dsRNA構(gòu)建體沉默了Foc引起香蕉巴拿馬病的這個(gè)基因。孢子的明顯減少（約95%）表明，SGE1可能是香蕉植物HIGS的一個(gè)有希望的候選者。Pareek和Rajam（2017）制作了RNAi菌株的F.oxysporum靶向MAP激酶信號(hào)基因Fmk1、Hog1和Pbs2。RNAi菌株對(duì)番茄的毒力降低。此外，RNAi介導(dǎo)的FoPEX6的沉默，減少了孢子的產(chǎn)生，導(dǎo)致番茄上的毒力急劇下降。

同樣，Dou等人（2020年）采用HIGS靶向ERG6/ERG11（麥角甾醇生物合成）基因，產(chǎn)生了抗Foc的轉(zhuǎn)基因ERG6-RNAi和ERG11-RNAi香蕉植物。Pérez等人（2020）在轉(zhuǎn)基因大豆品系中表達(dá)了對(duì)應(yīng)于F. oxysporum的CYP51B基因的siRNA。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾龋D(zhuǎn)基因大豆植物顯示出對(duì)F. oxysporum的抗性，表現(xiàn)為更好的芽和根生長（表1）。最近，Singh等人（2020年）通過HIGS靶向鳥氨酸脫羧酶（ODC），這是F. oxysporum f. sp. lycopersici的一個(gè)重要的多胺生物合成基因。多胺如亞精胺、腐胺和精胺對(duì)該真菌的正常生長和發(fā)育非常重要。表達(dá)的siRNA表現(xiàn)出輕度到高度的抗性在轉(zhuǎn)基因番茄品系中對(duì)鐮刀菌枯萎病的影響。最近，Tetorya和Rajam（2018，2021）探索了RNAi介導(dǎo)的編碼過氧化物酶體生物生成因子和β-1,3葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的基因沉默的潛力，以賦予轉(zhuǎn)基因番茄植物對(duì)鐮刀菌枯萎病的抗性。這些基因的片段被用來生成發(fā)夾式RNAi構(gòu)建體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將其轉(zhuǎn)化為番茄。表達(dá)這些構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因品系顯示出對(duì)Fol的抗性增強(qiáng)，這體現(xiàn)在疾病癥狀的發(fā)展延遲。

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其他鐮刀菌物種中的HIGS

除了F. graminearum和F. oxysporum之外，HIGS也被應(yīng)用于其他鐮刀菌物種。F. verticillioides是毒性真菌之一，在玉米（Zea mays）穗中產(chǎn)生伏馬菌素作為一種霉菌毒素。由于輪枝菌是一種種子傳播的病原體，因此難以控制，基于RNAi的新策略可能旨在減少伏馬菌素的污染。Johnson等人（2018年）產(chǎn)生了含有伏馬菌素生物合成基因FUM1和FUM8的RNAi構(gòu)建的伏馬菌素轉(zhuǎn)化體。由此產(chǎn)生的幾個(gè)轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出FUM1基因的表達(dá)減少，而且值得注意的是，伏馬菌素B1的含量減少了3675倍。減少FUM8的表達(dá)導(dǎo)致伏馬菌素B1的含量減少2240倍。這些結(jié)果表明，可以采用HIGS來沉默玉米中的FUM1或FUM8基因，并減少伏馬菌素的污染。Chen等人（2016年）在F. culmorum中應(yīng)用HIGS來沉默目標(biāo)基因FcGls1或沉默三個(gè)目標(biāo)基因，即FcGls1、MAP激酶FcFmk1和幾丁質(zhì)合成酶FcChsV。所有用針對(duì)上述基因的RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因小麥植株在溫室和近地條件下都表現(xiàn)出對(duì)FHB的抗性增強(qiáng)（表1）。

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結(jié)論和未來前景

沉默真菌病原體的基本基因，如F. graminearum,?F. oxysporum,?F. solani,?F.verticillioides?和?F. proliferatum，可以賦予疾病抵抗力并減少霉菌毒素的產(chǎn)生。除了HIGS作為賦予長效保護(hù)的寶貴工具外，siRNA也可以作為外用制劑，以避免與植物轉(zhuǎn)化相關(guān)的困難。HIGS與其他生物技術(shù)工具相結(jié)合，如基因組編輯，特別是與簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）相關(guān)蛋白9（Cas9）相結(jié)合，可以成功地應(yīng)用于改善對(duì)真菌性植物疾病的控制。

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原文鏈接：

https://doi.org/10.1007/s41348-022-00613-8