大家還在用傳統(tǒng)的雙酶切系統(tǒng)在做載體構(gòu)建嗎？目的片段酶切，載體酶切，尋找多克隆位點，連接反應(yīng)。。。。前前后后做幾天還沒幾個陽性克隆，一不小心從頭開始。。。

正所謂分子克隆虐我千百遍，我待它仍如初戀。如果你還不知道無縫克隆技術(shù)就OUT啦！無需酶切，連接，無需載體去磷酸化，簡單的引物設(shè)計，一步到位的重組反應(yīng)，還能多片段組裝，集萬千寵愛于一身的無縫克隆技術(shù)，你不能不知道，讓我們來看下吧！

?

基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據(jù) DNA 片段與線性化載體末端的 15~25 nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的 DNA 定向克隆技術(shù)。

無縫克隆試劑盒，一次反應(yīng)可完成單至多個 DNA 片段的重組，最快僅需 5 分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于 95%，能夠一定程度上耐受未純化 PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。

實驗流程如下：

第一步：線性化克隆載體的制備

選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴增完

成。

① 酶切制備

推薦使用 Absin快速內(nèi)切酶進行雙酶切，使載體線性化完全，以降低轉(zhuǎn)化背景 ( 假陽

性克隆 )；若使用單酶切進行線性化，可以適當(dāng)延長酶切時間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

注意：經(jīng)雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；酶切完成后應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重組反應(yīng)。

② 反向 PCR 擴增制備

為減少擴增突變的引入，推薦使用高保真 PCR Mix 進行擴增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

如下圖所示，在克隆載體插入位點兩側(cè)設(shè)計一對方向相反的引物對載體進行擴增，通過跑膠回收獲取線性化載體片段即可。

第二步：PCR獲取目的片段

獲取目的片段首先我們要對插入的片段進行引物設(shè)計，然后在相應(yīng)的模板中進行目標(biāo)片段的擴增和回收即可。

①?PCR引物設(shè)計

PCR 引物的 5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的 15~25 nt（推薦18 nt）序列。插入片段正向擴增引物：5'—上游載體末端同源序列 + 酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴增序列— 3'；插入片段反向擴增引物：3'—基因特異性反向擴增序列 + 酶切位點（可選）+ 下游載體末端同源序列—5'

注意：盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進行克隆，當(dāng)載體克隆位點上下游25 nt區(qū)域內(nèi) GC 含量為 40%~60% 時，重組效率最高。

如下圖所示在不同的載體末端引物設(shè)計的說明，假如載體為粘性末端，且 3' 端突出，則引物設(shè)計必須包含突出部分；若5' 端突出，則引物設(shè)計可以包含突出部分，也可以不包含。

② 目的片段的PCR擴增

推薦使用高保真 PCR Mix 進行擴增，以減少擴增突變的引入。建議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進行無縫克隆反應(yīng)，若 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的 20%。

?

第三步：無縫克隆反應(yīng)

?????按照一定的比例將線性化載體、目的片段混合在LightNing DNA Assembly Mix Plus的預(yù)混液內(nèi)，50℃反應(yīng)5-60min后（單片段最快5min完成重組）直接轉(zhuǎn)化 E.coli 即可。

注意：插入1~2 個片段時，推薦反應(yīng)時間為5~15 min；插入3~5 個片段時，推薦反應(yīng)時間為15~30 min；當(dāng)載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時，建議延長反應(yīng)時間到30~60 min；50℃反應(yīng)完成后，建議進行瞬時離心，將反應(yīng)液收集至管底。

?

通過以上的三步就可完成質(zhì)粒重組，只需要再進行后面的轉(zhuǎn)化感受態(tài)等等操作，就可以完成載體構(gòu)建實驗啦。哇哦~~簡直不要太好用，引物設(shè)計簡單，實驗操作簡單，陽性克隆率高，想連哪里連哪里，多個片段也沒有問題，麻麻再也不用擔(dān)心我的學(xué)習(xí)！

推薦試劑

更多精彩，可關(guān)注：優(yōu)寧維分子生物學(xué)，進行了解