pull down和免疫共沉淀
Pull Down與免疫共沉淀都是用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的分析方法,二者在原理上存在差異。免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)通過(guò)使用靶蛋白特異性抗體來(lái)間接捕獲與特定靶蛋白結(jié)合的蛋白,從而識(shí)別生理相關(guān)的蛋白-蛋白相互作用,進(jìn)一步分析這些蛋白質(zhì)復(fù)合物可以鑒定新的結(jié)合蛋白、結(jié)合親和力、結(jié)合動(dòng)力學(xué)以及靶蛋白的功能。Co-IP是免疫沉淀(IP)的延伸,原理也與IP相同,只是與抗原相結(jié)合的蛋白質(zhì)也被沉淀下來(lái)。因此,一個(gè)實(shí)驗(yàn)是否被稱為IP或Co-IP取決于實(shí)驗(yàn)的焦點(diǎn)是主要目標(biāo)(抗原)還是次要目標(biāo)(相互作用蛋白質(zhì))。Co-IP常用于分析多種蛋白質(zhì)的相互作用及其功能,抗體的選擇對(duì)Co-IP是否成功至關(guān)重要。因此,在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該準(zhǔn)確預(yù)測(cè)與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。
Pull Down是一種類似于免疫沉淀的親和純化技術(shù),只是使用“誘餌”蛋白代替抗體。親和層析(即親和純化)方法大大提高了蛋白質(zhì)純化的速度和效率,同時(shí)提供了對(duì)潛在蛋白結(jié)合體進(jìn)行下拉或共純化的技術(shù)平臺(tái)。在Pull Down分析中,將被親和試劑標(biāo)簽標(biāo)記的誘餌蛋白固定在固體基質(zhì)上,從而產(chǎn)生用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白的“二級(jí)親和載體”。然后將含有誘餌蛋白的二級(jí)親和支持物與含有假定的“獵物”蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物如細(xì)胞裂解物一起孵育,可與該誘餌蛋白相互作用的“獵物”蛋白便被捕獲。
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