P2 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)

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與堿基相連的是1號(hào)C 與磷酸相連的是5號(hào)C

磷酸二酯鍵——維系DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)

共價(jià)鍵：共用最外層電子

脫氧核苷酸是DNA的基本單位

Chargaff定則

衍射圖片

Steve Bell（not）

視頻見BV13x411U71C

DNA：雙鏈

雙鏈DNA最常見形式——B型DNA

DNA每一條鏈稱為多核苷酸連，這條鏈由許多個(gè)單核苷酸單元構(gòu)成

核苷酸單元：

一分子五碳糖 一分子磷酸基團(tuán) ATCG四種堿基其一構(gòu)成

A腺嘌呤 G鳥嘌呤 T胸腺嘧啶 C胞嘧啶

碳基與1位碳原子相連

一個(gè)糖的5號(hào)碳與另一個(gè)糖的3號(hào)碳之間有個(gè)磷酸

糖的二號(hào)位碳原子少了個(gè)羥基 所以叫脫氧核糖

所以DNA中的核苷酸稱為脫氧核苷酸

脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵在DNA鏈中彼此相連

核苷酸的磷酸基團(tuán)連接鄰位核苷酸的3'位氧原子

5'→3' & 3'→5'

脫氧核苷酸通過共價(jià)鍵形成骨架

DNA的兩條鏈通過堿基之間的氫鍵互相結(jié)合

螺旋的每一圈大約包含10個(gè)堿基對(duì)

除了堿基間的氫鍵 堿基堆積也能穩(wěn)定雙螺旋

堿基中相鄰的芳香環(huán)相互疊加 共享電子云 形成π-π鍵

雙螺旋結(jié)構(gòu)上的規(guī)律性形成兩部分重復(fù)交替的空間叫做大溝和小溝

這些溝扮演了堿基識(shí)別與蛋白結(jié)合的位點(diǎn)

大溝包含特異性堿基對(duì) 小溝包含非特異性堿基對(duì)

原因：能與蛋白質(zhì)互相結(jié)合的氫鍵受體與供體存在于溝內(nèi)

所以DNA可以看做特異性或非特異性序列 從而使蛋白質(zhì)能夠正確結(jié)合在相應(yīng)基因上 發(fā)揮作用

P3 DNA復(fù)制的基本特性

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高速性：1000個(gè)堿基對(duì)每秒

完備性：每個(gè)堿基都會(huì)復(fù)制到（除端粒）

準(zhǔn)確性：100億個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)一個(gè) 大多數(shù)錯(cuò)誤是非編碼區(qū)的錯(cuò)

• 端粒：

端粒是位于染色體末端的重復(fù)的非編碼DNA序列 和蛋白質(zhì)的復(fù)合物

• 功能：

保護(hù)染色體的末端 防止染色體相互結(jié)合 以及免受 核酸酶的降解

• 染色體復(fù)制端粒不復(fù)制 所以它會(huì)不斷變短
• 端粒酶用來(lái)修復(fù)端粒酶的縮短

分裂旺盛的細(xì)胞里端粒酶活性高 如生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、癌細(xì)胞

Steve Bell

DNA復(fù)制的根本原因是細(xì)胞要復(fù)制的基因組

基因組包含細(xì)胞各項(xiàng)功能的藍(lán)本

DNA復(fù)制的特點(diǎn):

1.快

每秒能夠合成100-1000個(gè)堿基對(duì)（bp/sec）

2.完備

基本上 除了極個(gè)別的情況 基因組中每一個(gè)堿基對(duì)都會(huì)被復(fù)制（端粒有些堿基對(duì)不被復(fù)制）

3.精確

通常而言 每合成100億（10的10次方）個(gè)堿基對(duì)會(huì)出現(xiàn)1次錯(cuò)誤

人有30億個(gè)堿基對(duì) 大概每分裂3次出一次錯(cuò)誤 不過100億個(gè)堿基對(duì)大部分沒有編碼功能 錯(cuò)不錯(cuò)無(wú)所謂

BUT

如果錯(cuò)誤發(fā)生在編碼區(qū)中間 這會(huì)改變編碼處的氨基酸和蛋白質(zhì) 這就是一個(gè)問題了

一個(gè)細(xì)胞里DNA的長(zhǎng)度大約有2m 全是大約9千萬(wàn)英里 足夠你去太陽(yáng)了 這一生你大概合成1ly的DNA

復(fù)制經(jīng)常作為藥物靶點(diǎn) 大部分一線化療藥物都是以復(fù)制為靶點(diǎn)

P4 DNA復(fù)制的化學(xué)基礎(chǔ)

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DNA合成需要引物 這是DNA聚合酶的性質(zhì)決定的

聚合酶不能從頭合成DNA 它只能延伸 所以必須需要引物

引物在體內(nèi) 是由引物酶合成的一段RNA 最短大約能到兩個(gè)核苷酸

由引物3'羥基 親核進(jìn)攻dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）中的二法磷酸酯鍵

原子核帶正電核外電子帶負(fù)電

親核進(jìn)攻：一個(gè)電子云密度大的基團(tuán) 進(jìn)攻帶正電 或電子云密度較小的基團(tuán) 從而發(fā)生的反應(yīng)

在這里 羥基的氧進(jìn)攻磷酸基的磷

本質(zhì)上是一個(gè)親核取代

DNA合成的方向5'→3'

DNA合成就是引物三端延伸的過程。

DNA合成的過程不可逆。

Steve Bell

引物-模板接頭（DNA復(fù)制底物）

引物有一個(gè)游離的3'-OH

引物游離的羥基攻擊dNTP的α-磷酸基團(tuán)

脫下一分子焦磷酸鹽

只有引物堿基與模板堿基正確配對(duì)時(shí) 反應(yīng)才會(huì)發(fā)生

第二個(gè)反應(yīng)會(huì)分解焦磷酸鹽（PPi 由兩分子的焦磷酸鹽偶聯(lián)形成）形成兩分子磷酸 鹽驅(qū)動(dòng)反 從而使之不可逆

在磷酸鹽酶的作用下，該反應(yīng)的ΔG=-7kcal（ΔG<0時(shí)反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行）

在沒有磷酸鹽酶的作用下，該反應(yīng)的ΔG=-3.5-kcal

這仍是正反應(yīng) 該過程是不可逆的

為了確保反應(yīng)正向進(jìn)行 細(xì)胞不止釋放焦磷酸鹽 而且還會(huì)迅速捕獲焦磷酸鹽 將其分解為兩分子磷酸鹽

DNA聚合酶催化了這個(gè)反應(yīng)

DNA聚合酶需要：

1.引物3'端羥基

2.引物必須與另一條更長(zhǎng)的單鏈DNA退火 因此需要引物3'羥基與單鏈DNA緊密相連

• 1&2結(jié)合起來(lái)稱為引物-模板接（PTJ）

3.全部4種dNTP

4.加入的dNTP必須能與模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)

5.此化學(xué)反應(yīng)會(huì)通過合成核苷酸鏈來(lái)延伸引物的3端

才能進(jìn)行催化反應(yīng)（被延長(zhǎng)的始終是引物）

P5 DNA聚合酶的活性中心

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DNA聚合酶活性中心對(duì)脫氧核苷酸的識(shí)別

兩個(gè)機(jī)制：

動(dòng)力學(xué)機(jī)制

空間位阻

游離的rNTP是dNTP的200多倍 所以復(fù)制時(shí)不可避免出現(xiàn)添加rNTP的情況 空間位阻是阻止這種情況發(fā)生的機(jī)制（但不代表不發(fā)生）

發(fā)生后 要改

細(xì)胞通過RNaseH（RNA酶h）來(lái)切除錯(cuò)誤添加的rNTP

RNaseH在真核生物里分為H1和H2 它們都能切除DNA-RNA的雜交區(qū)域

H1要有4個(gè)連續(xù)的rNMP才能識(shí)別

去除rNTP的主要是H2 可以切除單個(gè)核糖核苷酸 H2有周期性 切除核糖核苷酸主要是G2期

切除-修復(fù)機(jī)制：

H2可以在rNMP的5端把鏈斷開 引入3'羥基和5'磷酸

然后從3'OH開始DNA聚合酶把缺口合成

這時(shí)產(chǎn)生了翅膀一樣的結(jié)構(gòu)——側(cè)翼（就是一段NDA連了一個(gè)rNMP）

內(nèi)切酶/外切酶把側(cè)翼切掉 切口連接酶補(bǔ)起來(lái)

Steve Bell

DNA聚合酶只有一個(gè)活性位點(diǎn)

那它怎么做到添加4中dNTP？

DNA聚合酶它不在乎！

因?yàn)閷?duì)于這四種堿基而言 距離是相同的

DNA不同的核苷酸是以完全相同的方式排列的

這對(duì)一酶多吃是至關(guān)重要的

核苷酸們只有形成堿基對(duì) 才能發(fā)生催化反應(yīng)

當(dāng)堿基正確配對(duì)時(shí) 只需要將三磷酸基團(tuán)放在正確的位置

引物（primer）3'端的羥基就可以SN2親核進(jìn)攻（發(fā)生在磷酸基上）

如果A配A 盡管在結(jié)合的口袋附近有一定的親和力 但磷酸基團(tuán)的位置不正確 羥基不能親核進(jìn)攻它

錯(cuò)配類型不同 它的位置也不一樣

α-磷酸基和3'羥基的位置正確才能發(fā)生反應(yīng)（親核進(jìn)攻）

個(gè)個(gè)堿基對(duì)的尺寸相似 正確的堿基配對(duì)能讓3'端羥基所處的位置距離dNTP的α-磷酸基團(tuán)最近

這就是細(xì)胞保障聚合時(shí)雙鏈配對(duì)正確

這一過程產(chǎn)生的錯(cuò)誤越多 反應(yīng)速度越慢

P6 DNA聚合酶活性中心對(duì)小溝的識(shí)別

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氫鍵：電負(fù)性大的原子結(jié)合的氫與另一個(gè)電負(fù)性大原子之間 靜電引力

就是X——H丶丶丶Y

一般X Y基本是氧 氮 氟

當(dāng)H和O N F結(jié)合的時(shí)候 比如H2O 氨氣和氟化氫 這三個(gè)因?yàn)樵影霃綁蛐?電負(fù)性夠大 所以共價(jià)鍵電子云極大偏向這些原子 氫核幾乎裸露

電子云偏了以后 氫核帶正電 這些電負(fù)性大的原子帶負(fù)電 正負(fù)電荷之間互相吸引 形成氫鍵

共價(jià)鍵是共享

氫鍵是偏向 它比離子鍵共價(jià)鍵都弱 但是分子之間的·作用力強(qiáng)

氫鍵分兩種形式：

• 分子間

分子間氫鍵會(huì)提高化合物的沸點(diǎn)

• 分子內(nèi)

分子內(nèi)氫鍵會(huì)降低化合物的沸點(diǎn)

給出氫原子的叫供體 接受氫原子的叫受體

氫鍵就是供體和受體間的庫(kù)侖力

大溝：序列特異性

小溝：構(gòu)象特異性

氫鍵任意一個(gè)堿基對(duì) 蛋白質(zhì)從大溝能分辨出來(lái)是GC還是CG 但是從小溝看來(lái)是一樣的

圖上A是受體 D是供體

大溝上 如果是GC 那就是AADH 如果是CG就是HDAA 小溝都是ADA

Steve Bell

聚合酶的樣子

DNA聚合酶有好幾種 通常情況下 他們的基本結(jié)構(gòu)都差不多

“fingers”在催化反應(yīng)的過程中會(huì)動(dòng) thumb不動(dòng)

手掌“palm”結(jié)合引物模板接頭以及部分新合成的DNA

上圖：

活性位點(diǎn)之后就是模板

后面的DNA單鏈彎曲了45度 這意味著活性位點(diǎn)附近唯一能配對(duì)的堿基是緊接著前面配對(duì)完成的那一個(gè)

聚合酶與無(wú)關(guān)序列的磷酸骨架結(jié)合

如果需要特異性序列結(jié)合蛋白質(zhì)去識(shí)別DNA 那么它應(yīng)該結(jié)合大溝

A供體 D受體

大溝中氫鍵的供體和受體有許多有趣的類型 它們差別很大

通過觀察大溝 根據(jù)你得到的堿基對(duì) 你能得到其所有的信息 你可以分辨出它是GC（AT）殘基還是GC （TA）殘基

小溝只有中間氫鍵不同 兩側(cè)的氫鍵都一樣 并且它們?cè)谕耆嗤奈恢?因此無(wú)論堿基對(duì)是哪個(gè) 小溝中的氫鍵受體對(duì)都是一樣的

小溝中互相作用沒有序列特異性 但有堿基配對(duì)特異性

這使得DNA聚合酶能夠無(wú)視序列特異性結(jié)合DNA 還能識(shí)別這就是堿基對(duì)

如果是AG 那就亂套了 它們的位置不對(duì) 聚合酶能識(shí)別這一點(diǎn) 這會(huì)使兩個(gè)受體扭曲 聚合酶就會(huì)知道新合成的DNA不對(duì)

因此 它不僅能檢測(cè)出所以不同的序列 還能檢測(cè)堿基對(duì)是否正確

P7 DNA聚合酶手指結(jié)構(gòu)域的催化原理

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引物模板接頭在掌心

手掌結(jié)構(gòu)域上

合成位點(diǎn)包含2個(gè)二價(jià)金屬離子 可以改變正確配對(duì)的dNTP與引物3'端羥基的化學(xué)環(huán)境

一個(gè)二價(jià)金屬：ionA 另一個(gè)二價(jià)金屬：ionB

ionA能夠和引物的3'羥基的H相互作用

O進(jìn)攻α-P 發(fā)生親核取代 金屬離子的作用就是活化羥基中的氧原子 即去質(zhì)子化

ionB用來(lái)穩(wěn)定β-P和γ-P 靜電引力 反應(yīng)玩就是PPi

手指結(jié)構(gòu)域

當(dāng)新進(jìn)的dNTP正確配對(duì)的時(shí)候 手指結(jié)構(gòu)域里有一個(gè)α-螺旋（steve bell叫O-螺旋 O-螺旋就是α-螺旋一種）

α-螺旋上的氨基酸殘基能夠和新近加入的dNTP相互作用 能讓O-螺旋彎曲40° 讓核心酶封閉起來(lái)（穩(wěn)定dNTP）

α-螺旋上的酪氨酸（Tyr）會(huì)和堿基平面相互作用 酪氨酸是芳香族化合物 帶苯環(huán) 會(huì)和核苷酸里的環(huán)形成π-π堆積（非共價(jià)鍵）

• π-π堆積是芳香化合物的一種特殊空間排布，指一種常常發(fā)生在 芳香環(huán) 之間的 弱相互作用 ，通常存在于相對(duì)富電子和缺電子的兩個(gè)分子之間，是一種與氫鍵同樣重要的非共價(jià)鍵相互作用。

另外兩個(gè)氨基酸 賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）分別跟β-P和γ-P相互作用

Steve Bell

dNTP由堿基配對(duì)介導(dǎo) 同時(shí)整合了二價(jià)金屬陽(yáng)離子（通常Mg2+）

使用二價(jià)金屬螯合劑 如EDTA之類的 幾乎可以讓任何DNA聚合酶失活

準(zhǔn)備添加的核苷酸會(huì)和母鏈與之配對(duì)的堿基形成氫鍵 氫鍵是結(jié)合核苷酸的一種機(jī)制

另一種是三磷酸鹽和二價(jià)金屬的作用 提供額外支持 將核苷酸固定在應(yīng)有的位置 從而保證催化的進(jìn)行

同時(shí)發(fā)生的還有另一件事 也就是O-螺旋

以前說過 手指結(jié)構(gòu)會(huì)在結(jié)合的dNTP周圍開合 這就涉及O-螺旋

這是由于酪氨酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu) 與添加的核苷酸之間形成了π-π鍵 互相作用發(fā)生在六元環(huán)部分

無(wú)論是一個(gè)六元環(huán)和一個(gè)五元環(huán)的嘌呤 還是只是一個(gè)六元環(huán)的嘧啶 都能與酪氨酸發(fā)生反應(yīng) 促使O-螺旋靠近dNTP

另外 賴氨酸和精氨酸會(huì)和β、γ位的磷酸相互作用 這些相互作用使得O-螺旋被壓到堿基對(duì)上方 一個(gè)重要作用是防止水解的發(fā)生 這樣水就不能進(jìn)入活性中心 唯一發(fā)生的反應(yīng)就是羥基進(jìn)攻磷酸基團(tuán)

π-π鍵結(jié)合堿基

賴氨酸與精氨酸結(jié)合三磷酸鹽

接下來(lái)

釋放焦磷酸鹽和O-螺旋

當(dāng)兩個(gè)磷酸基被釋放時(shí) 賴氨酸和精氨酸對(duì)位于此位堿基的吸引力大大下降 它們會(huì)彈出去

如果它恢復(fù)原狀 從有吸引力的狀態(tài)變成沒有吸引力的狀態(tài)

這時(shí)當(dāng)我們添加核苷酸完成時(shí) 它將不再是之前的樣子

這里有對(duì)堿基對(duì) 但堿基對(duì)和聚合酶之間沒有很強(qiáng)的相互作用 聚合酶希望這里能有個(gè)3'羥基而不是下一個(gè)位置

把單鏈DNA模板移動(dòng)到這里 令DNA整個(gè)下降 聚合酶與這種形式的底物具有較高的相互作用

單鏈DNA只需移動(dòng)一個(gè)位置就能做到 因?yàn)榫酆厦概c雙鏈DNA的相互作用是非特異性的 所以從能量的角度而言 移動(dòng)DNA相當(dāng)于手掌位置移動(dòng)一個(gè)堿基對(duì)

移動(dòng)一個(gè)堿基對(duì) 不會(huì)改變與聚合酶間的相互作用 但和3端移動(dòng)后的位置相比 原來(lái)的位置與DNA聚合酶間的相互作用要弱的多

移動(dòng)一個(gè)堿基只需一毫秒

P8 DNA聚合酶的校正功能

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手掌結(jié)構(gòu)域，3→5的外切酶（一個(gè)酶一個(gè)結(jié)構(gòu)域上不同的兩個(gè)活性位點(diǎn)）

當(dāng)錯(cuò)誤的核苷酸摻入合成鏈的時(shí)候（互變異構(gòu)）不需要把這盒內(nèi)取下來(lái)?yè)Q一套糾正的系統(tǒng) 聚合酶會(huì)自我糾正

當(dāng)錯(cuò)配發(fā)生的時(shí)候 引物與活性中心親和力降低 這樣聚合酶就會(huì)等 合成速率就會(huì)跟著降低

隨后引物脫離 與校正妹點(diǎn)結(jié)合 外切酶切除

然后引入重新和活性中心結(jié)合

這一套過程能讓DNA聚合酶的保真度達(dá)到10的7次方分之一（一千萬(wàn)錯(cuò)一）

罪魁禍?zhǔn)祝夯プ儺悩?gòu)

兩種官能團(tuán)可以反復(fù)橫跳（一個(gè)原子在兩個(gè)位置之間秒速位移）

Steve Bell

DNA聚合酶大約每合成十萬(wàn)對(duì)堿基發(fā)生一次錯(cuò)誤

大多數(shù)的錯(cuò)誤是由于嘧啶換嘧啶或是漂亮換嘌呤造成的

如 它放了C而不是T 或者放了G而不是A

原因：互變異構(gòu)體

所有四種堿基都能在醇式與烯醇式 氨基與亞氨基之間轉(zhuǎn)換。

amino（氨基）imino（亞氨基）keto（酮式）enol（烯醇式）

上面的為正常形態(tài)

當(dāng)它轉(zhuǎn)化的同時(shí) 氫鍵的供受關(guān)系也會(huì)發(fā)生變化

會(huì)改變堿基配對(duì)的特異性

每10萬(wàn)個(gè)堿基會(huì)有一個(gè)發(fā)生變化 它會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N構(gòu)象

（對(duì)于G來(lái)說就是烯醇式 它能與胸腺嘧啶T配對(duì) 但是聚合酶還以為配對(duì)正確 因?yàn)槿绻茿 結(jié)構(gòu)也是一樣的）

當(dāng)堿基變構(gòu)時(shí) 聚合酶無(wú)法區(qū)分 還開心的添加T以為完成任務(wù)

但一旦T添加進(jìn)來(lái) G就不是烯醇 它馬上變回酮式

當(dāng)他移動(dòng)到下一個(gè)位置時(shí) 新加入的堿基就是錯(cuò)的了 DNA將不再維持雙鏈 其末端會(huì)解旋 不在形成 這會(huì)令聚合酶停止工作

考慮到3端OH位置 它的位置非常巧妙 正好可以和α-磷酸基團(tuán)相互作用

如果這個(gè)堿基是錯(cuò)誤的 二者就會(huì)互相排斥 當(dāng)輕劍不在互補(bǔ)時(shí) 就會(huì)出現(xiàn)這種情況 3端OH將不會(huì)出現(xiàn)在α-磷酸基團(tuán)需要的位置

一旦出現(xiàn)錯(cuò)誤 聚合酶會(huì)停下 互變異構(gòu)體產(chǎn)生的錯(cuò)誤的暫時(shí)的 但錯(cuò)配會(huì)減慢合成速度

它會(huì)使用校對(duì)核酸外切酶修正錯(cuò)誤

P9 DNA聚合酶的核酸外切酶活性

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上圖大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

作為一個(gè)聚合酶 有水解的活性

合成和水解的活性中心在同一條肽鏈上 為了平衡二者關(guān)系 注定了這個(gè)酶活性不會(huì)太高

所以在大腸桿菌里 聚合酶Ⅲ真正負(fù)責(zé)合成

聚合酶Ⅰ主要用來(lái)修復(fù)和補(bǔ)口的

右圖：“手”

3'5'外切酶是一個(gè)一個(gè)切的 切完之后可以用自己的聚合酶活性補(bǔ)上

正確配對(duì) 和合成中心親和性高

錯(cuò)誤配對(duì) 和校對(duì)中心親和性高

這保證了不會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)中心同時(shí)被激活的情況

Steve Bell

這不是合成的逆反應(yīng) 那邊有一個(gè)P 所以不是合成的逆反應(yīng)

because一旦兩個(gè)磷酸分開 合成反應(yīng)就是不可逆的

這些校對(duì)核酸外切酶先從一端降解DNA

校對(duì)核酸外切酶的工作方向是3'到5'

遇到錯(cuò)配反應(yīng)會(huì)變慢 錯(cuò)配時(shí)末端會(huì)不穩(wěn)定（至少最后一對(duì)堿基沒有配對(duì)）

通常 外切酶活性 和聚合酶活性都在同一條肽鏈上 也就是說 這條多肽同時(shí)具備合成和降解兩大技能

不穩(wěn)定或錯(cuò)配時(shí) DNA與聚合酶活性中心的親和力低 但他有引入的單鏈DNA末端 或是3端羥基 與核酸外切酶的活性位點(diǎn)親和性高

概括為此圖

這個(gè)不穩(wěn)定的末端是外切酶完美的底物

如果發(fā)生錯(cuò)配 沒有足夠的時(shí)間給外切酶修復(fù) 所以合成繼續(xù)

后面會(huì)將講解

P10 DNA聚合酶的檢測(cè)方法——摻入法

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摻入法

need：

噬菌體M13的基因組 單鏈的dna環(huán) 人工合成的引物（引物模板接頭（PTJ）它必須接著復(fù)制）緩沖液 dNTP（4種dNTP至少1種被標(biāo)記 可用熒光標(biāo)記或放射性同位素）

濾紙分析 我們最后測(cè)的是總的熒光或總的放射性強(qiáng)度 分不清聚合酶合了多少

電泳可用分開 電影本身就是依據(jù)片段大小不一樣 在凝膠里的電泳速度不同來(lái)分離的

Steve Bell

DNA聚合酶活性的檢測(cè)方法

• 摻入法
• 需要把聚合物（DNA）從原料里（dNTP）分離出來(lái)

1.合成一個(gè)具有引物-模板接頭的底物

一般用噬菌體M13 它的基因組是一個(gè)大的單鏈DNA 這些單鏈狀環(huán)DNA能夠被人工合成

M13有5000個(gè)堿基

這就是你的引物-模板接頭

我們把引物和單鏈DNA放到一起 金屬浴加熱到100度 3分鐘 拿出來(lái)放在那兒 然后放一段時(shí)間 退火就完成了

2.緩沖液+DNA聚合酶（我們認(rèn)為里面有它）

3.加入dNTP開始反應(yīng)（至少有一種dNTP被標(biāo)記 一般是熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記）

熒光標(biāo)記一般加在一個(gè)胸苷類似物上 所以能標(biāo)記堿基 只要胸苷上有甲基 你也可以加各種各樣的東西上去 可以在甲基上連一個(gè)很大的七元環(huán)

或者用32P代替磷酸基中的α磷原子

4.取時(shí)間點(diǎn) 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過SDS或EDTA終止反應(yīng) 把DNA從標(biāo)記過的dNTP中分離出來(lái)

如果你的合成反應(yīng)進(jìn)行的很成功 部分標(biāo)記過的dNTP就會(huì)摻入DNA聚合酶中 剩下的還留在體系里

那么如何區(qū)分被標(biāo)記的DNA和dNTP？

• 濾紙結(jié)合分析法

用一個(gè)帶正電的濾紙 即離子交換紙（DE81）

把反應(yīng)物點(diǎn)在濾紙上（好處在于反應(yīng)馬上停止 因?yàn)闆]有水）接著拿著膜 用含鹽的緩沖劑漂洗

鹽的濃度（一般用50mmol/L氯化鈉）正好能洗掉dNTP 而不會(huì)波及DNA

dNTP有三個(gè)負(fù)電荷

DNA有幾千個(gè)負(fù)電荷

要使分子從濾紙上洗脫下來(lái) 必須讓他所有的負(fù)電荷同時(shí)從濾紙上脫離 鹽離子可以做到這一點(diǎn)

當(dāng)鹽離子靠近并結(jié)合DNA的時(shí)候 它會(huì)取代濾紙上的正電荷 當(dāng)dNTP只有3個(gè)負(fù)電荷時(shí) 兩三毫秒就能脫離一個(gè)

你需要對(duì)地址進(jìn)行漂洗 一般洗三次

同位素標(biāo)記：收集上清 看看上清有沒有放射性 可以不斷的洗 直到上清里沒有放射性為止 然后可以檢測(cè)濾紙 看看上面放射性標(biāo)記的含量

如果是熒光標(biāo)記可能測(cè)起來(lái)不那么容易 但都是一個(gè)道理

接下來(lái) 測(cè)量相關(guān)的熒光或放射性強(qiáng)度 接著你就能計(jì)算參入核苷酸的含量 如果你準(zhǔn)確制造最初用的核苷酸熒光或放射性強(qiáng)度 那么你就能精確算出有多少核苷酸參入到了模板上

濾紙結(jié)合分析法

優(yōu)勢(shì)是快 定量（多長(zhǎng)時(shí)間多少個(gè)核苷酸參入了多少模板里）

缺點(diǎn)是不能夠提供長(zhǎng)度信息（不管是1000次10對(duì)堿基對(duì)的延伸 還是一次10000對(duì)堿基對(duì)的延伸 分析結(jié)果都完全相同）

如果想知道長(zhǎng)度信息 就需要、

• 凝膠

把以前的東西在做一次 然后用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

用TBE或TAE（一種緩沖液）配的瓊脂糖凝膠

把DNA變性 讓新合成的序列從環(huán)上脫離

如何變性？加熱95°

完后 用瓊脂糖凝膠 一般要加氫氧化鈉

用聚丙烯酰胺凝膠 一般加尿素

加氫氧化鈉和尿素的作用是能防止熱變性的DNA重新退火（無(wú)法退火重新結(jié)合）

然后用凝膠分離就行了

溴化乙錠可以染核酸（無(wú)論有沒有標(biāo)記）

30/60/90/120秒 合成的產(chǎn)物越來(lái)越多 引物被穩(wěn)定延長(zhǎng)

一般不會(huì)反應(yīng)掉所有模版 2/3模版被用掉了

只檢測(cè)輻射或熒光 只能看見DNA分子 看不到引物和模版 因?yàn)闆]有被標(biāo)記

凝膠

優(yōu)點(diǎn)：告訴產(chǎn)物·長(zhǎng)度信息

缺點(diǎn)：浪費(fèi)時(shí)間·20~幾個(gè)小時(shí) 定量效果不好

P11 DNA聚合酶的檢測(cè)方法——引物延伸法

生命中國(guó)的叨叨

標(biāo)記引物

需要的東西：模板、緩沖液、聚合酶、標(biāo)記的引物、沒標(biāo)記的dNTP

如果只標(biāo)記引物 得到的所有產(chǎn)物 熒光強(qiáng)度或者放射性強(qiáng)度都一樣（Because引物是一樣的 標(biāo)記的量也一樣）

跑膠的時(shí)候要用變性凝膠

變性凝膠：

如瓊脂糖凝膠加氫氧化鈉 聚丙烯酰胺凝膠加尿素 用來(lái)防止DNA復(fù)性 否則產(chǎn)物和模板在一塊 會(huì)退火復(fù)性 就會(huì)產(chǎn)生很多不同結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)不同遷移率也不同

變性就是為了讓核酸在凝膠中的遷移率和其他東西無(wú)關(guān)系 只和它的分子量有關(guān)

如果忘記用變性凝膠呢

這意味著產(chǎn)物和模板會(huì)結(jié)合在一起 跑出來(lái)如下圖

中產(chǎn)物和模板差不太多，5000bp左右（取決于DNA聚合酶的合成能力）

Steve Bell

與摻入法的差別：被標(biāo)記的是底物（在該實(shí)驗(yàn)為引物 被同位素或熒光標(biāo)記）dNTPs不被標(biāo)記

這樣你合成了個(gè)標(biāo)記的Primer Template Junction

標(biāo)記一般必須在primer（引物）上

因?yàn)楹铣赏旰?引物就是產(chǎn)物一部分 而模板分離后就不是產(chǎn)物了

反映完后不能用濾紙分析

如果體系里完全沒有DNA聚合酶 濾紙上會(huì)留存大量標(biāo)記DNA 如果你完成了合成反應(yīng)濾紙上一樣會(huì)有大量標(biāo)記DNA（因?yàn)槠鹗嫉孜锱c最終產(chǎn)物的標(biāo)記量基本相同）

可以用凝膠分離

左圖溴化乙錠染色（與原來(lái)結(jié)構(gòu)差不多）

右圖檢測(cè)放射性同位素或熒光標(biāo)記（產(chǎn)物越來(lái)越長(zhǎng) 條帶亮度差不多 因?yàn)闊o(wú)論產(chǎn)物是多少個(gè)堿基 它們引物標(biāo)記的都是一樣的）

P12 DNA聚合酶的續(xù)航能力及其檢測(cè)

生命中國(guó)的叨叨

DNA聚合酶的續(xù)航能力——processivity（持續(xù)合成能力）

持續(xù)合成能力是酶針對(duì)聚合物的特征 聚合物是由單體構(gòu)成の 所以酶就必須不斷添加單體

即聚合酶結(jié)合引物模板接頭的時(shí)候 所能添加dNTP的個(gè)數(shù)

不同的聚合酶持續(xù)合成能力是不一樣的 用來(lái)修復(fù)的聚合酶 大概一次結(jié)合只能添加20個(gè)dNTP

如何檢測(cè)？模板競(jìng)爭(zhēng)分析（template challenge assay）

• 用兩種PTJ 一種標(biāo)記 一種不標(biāo)記
• 然后加入兩倍（指數(shù)量）標(biāo)記PTJ濃度 的DNA聚合酶
• 這時(shí) 所有標(biāo)記過的PTJ都結(jié)合上了聚合酶
• 下面 加入1000倍濃度的沒有標(biāo)記的PTJ 給時(shí)間讓聚合酶繼續(xù)反應(yīng) 讓它足夠復(fù)制玩整個(gè)模板
• 跑膠

• 酶合成能力高可用完整復(fù)制（結(jié)合的PTJ一定會(huì)被標(biāo)記 因?yàn)槭窍燃尤氲木酆厦? 再加入沒有標(biāo)記的PTJ）
• 合成能力低 跑一段 聚合酶就會(huì)脫落后再結(jié)合另一個(gè)PTJ 此時(shí)沒有標(biāo)記的PTJ比標(biāo)記的PTJ多 大概率結(jié)合的是沒有標(biāo)記的PTJ 沒標(biāo)記的 測(cè)不出來(lái) 標(biāo)記過的 結(jié)合不上 低續(xù)航能力的聚合酶只能合成幾十個(gè)堿基就沒了 也就是該圖底下的這個(gè)

Steve Bell

持續(xù)合成能力

做用于聚合物的酶的性質(zhì)

普通概念：每個(gè)聚合物結(jié)合的酶的反應(yīng)循環(huán)數(shù)

DNA聚合酶概念：每次聚合酶結(jié)合引物模板接頭的時(shí)候摻入dNTP的個(gè)數(shù)

在溶液中DNA聚合酶結(jié)合一個(gè)PTJ大約需要一秒鐘（為擴(kuò)散控制反應(yīng)）

一旦與PTJ結(jié)合 聚合酶每摻入一個(gè)dNTP只需一毫秒

這意味著如果你已經(jīng)有結(jié)合模板的聚合酶 那么在另一個(gè)聚合酶與心奴版結(jié)合之前，你能夠合成1000個(gè)堿基對(duì) 所以 如果想合成大量DNA 需要一個(gè)能有效持續(xù)合成的dna聚合酶

聚合酶的持續(xù)合成能力千差萬(wàn)別 這種差別隨著如DNA修復(fù)聚合酶的持續(xù)合成能力很差 合成PTJ時(shí)候大約合成10~20個(gè)堿基對(duì)

DNA或每次合成的PTJ時(shí)候能夠合成>50000個(gè)堿基對(duì)

持續(xù)合成能力可以幫助我們區(qū)分哪種聚合酶適合哪類工作

那么如何知道它的持續(xù)合成能力如何？

模板競(jìng)爭(zhēng)分析

1.準(zhǔn)備兩種PTJ 一種引物標(biāo)記（PTJ，黃色高光表示被標(biāo)記） 一種引物不標(biāo)記（PTJ）還有一些緩沖液之類的老牌東西

2.加入PTJ 接著加入2倍PTJ濃度的聚合酶

3.然后向體系里加入沒有標(biāo)記的dNTP 開始合成反應(yīng) 同時(shí)加入1000倍未標(biāo)記的PTJ

現(xiàn)在所有PTJ都結(jié)合了聚合酶 然后加dNTP和大量沒有標(biāo)記的PTJ 然后讓反應(yīng)時(shí)間足夠長(zhǎng) 足以合成全長(zhǎng)產(chǎn)物

30min后 終止反應(yīng) 凝膠電泳分離產(chǎn)物

第一次結(jié)合PTJ后發(fā)生了什么事？

加入PTJ后 我們還加入了1000倍相同的沒有標(biāo)記的PTJ 所以聚合酶更容易結(jié)合到?jīng)]有標(biāo)記的PTJ 在那里合成下一串DNA 可是因?yàn)闆]有被標(biāo)記 我們也看不到

所所以約等于只測(cè)第一次結(jié)合時(shí)的合成情況

P13 真實(shí)實(shí)驗(yàn)中的DNA群體行為

生命中國(guó)的叨叨

離心管里的反應(yīng)不是一個(gè)模板 一個(gè)酶 而是成千上萬(wàn)的模板和酶

那為何不是一個(gè)模板一個(gè)酶？無(wú)法檢測(cè)

如果單分子反應(yīng)去跑膠 當(dāng)然跑不出來(lái)

如果其他方式 如 單分子熒光檢測(cè)

過去把生物材料均一化 認(rèn)為DNA、細(xì)胞行為是一致的

實(shí)際上是用群體行為掩蓋了個(gè)體差異 單分子反應(yīng)很多時(shí)候不可預(yù)測(cè) 它是隨機(jī)性在起作用 很多時(shí)候相同的基因型表現(xiàn)型不同 這是隨機(jī)因素在起作用

Steve Bell（not）

在離心管中會(huì)發(fā)生什么？

我們真的只有一分子DNA和環(huán)狀結(jié)構(gòu)嗎？

如果指望能單分子反應(yīng) 現(xiàn)在來(lái)說還是想多了 我們不能看到任何結(jié)果

跑膠完了什么也看不見 因?yàn)閱畏肿拥男盘?hào)太弱了

我們能在凝膠上看見的條帶 是由長(zhǎng)度相同 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同的所以他們能夠遷移到凝膠里的同一位置

如果只有一個(gè)分子 那什么也看不見了

實(shí)際上我們的離心管里有大量分子

并不是每一個(gè)引物都能結(jié)合模板 也不是每一個(gè)引物模板接頭都能結(jié)合聚合酶

但是因?yàn)榛鶖?shù)大 所以基本上離心管里的分子還是會(huì)按照你預(yù)測(cè)的方式反應(yīng)

所以跑膠后能看見你想要的結(jié)果

這也是為什么你經(jīng)常還會(huì)看到凝膠底部朝著正極方向移動(dòng)的引物二聚體

如果開始時(shí)候引物加的太多 那肯定會(huì)剩下

所以以后看到這種示意圖的時(shí)候要知道這不是一個(gè)分子 而是千萬(wàn)億個(gè)分子

P14 真實(shí)細(xì)胞中的DNA復(fù)制過程

生命中國(guó)的叨叨

細(xì)胞器是細(xì)胞里最容易觀察的結(jié)構(gòu)

兩條鏈 打開

前導(dǎo)鏈3'→5' 持續(xù)合成 時(shí)間短

后隨鏈5'→3' 一段段復(fù)制 岡崎片段

DNA聚合酶復(fù)制方向5'→3'

Steve Bell

復(fù)制叉

P15 DNA聚合酶和它的小伙伴兒

生命中國(guó)的叨叨

復(fù)制叉——Y形結(jié)構(gòu)

從復(fù)制起點(diǎn)開始 它可以單項(xiàng)也可以雙向

1.DNA聚合酶

不能從頭合成 必須需要PTJ

2.DNA引物酶

本質(zhì)是特殊的RNA聚合酶

3.DNA解旋酶

（具體見圖片PPT）

滑動(dòng)夾：

習(xí)題：

Steve Bell

大多數(shù)情況 cell里的DNA復(fù)制是從復(fù)制叉這個(gè)結(jié)果開始的

1.前導(dǎo)鏈DNA聚合酶

移動(dòng)方向與整體復(fù)制方向相同

移動(dòng)方向?yàn)樯形磸?fù)制的DNA

2.后隨鏈DNA聚合酶

移動(dòng)方向背離DNA整體復(fù)制方向

后隨鏈的復(fù)制需要一段段進(jìn)行——岡崎片段（或后隨鏈片段）

當(dāng)岡崎片段遇到引物（下一個(gè)復(fù)制起始的引物）時(shí) 就會(huì)終止復(fù)制

因?yàn)闆]有東西給他復(fù)制了 沒有PTJ 沒有ssDNA 他就會(huì)解離下來(lái) 然后重新的引物那邊再開始復(fù)制

3.引物酶primase

一種特殊的RNA聚合酶

在復(fù)制叉處合成6~8個(gè)堿基對(duì)的RNA引物

Q: 為何需引物酶？

A: dna聚合酶無(wú)法直接拿兩個(gè)核苷酸開始合成型片段 它必須有一個(gè)引物

它需要PTJ 模板可以是RNA/DNA

RNA聚合酶不像DNA聚合酶 RNA聚合酶可以連接兩個(gè)核糖核苷酸 開始成鏈

（在細(xì)菌中）引物酶在復(fù)制叉處起作用的原因在于 復(fù)制叉上的另一個(gè)酶會(huì)激活它 那個(gè)酶就是——

4.DNA解旋酶

見下節(jié)課

（在真核細(xì)胞中 解旋酶拉著引物酶緊密結(jié)合后隨鏈聚合酶不分離）

P16 DNA解旋酶

生命中國(guó)的叨叨

DNA聚合酶：復(fù)制解旋酶

解旋酶環(huán)繞單鏈?zhǔn)腔钚誀顟B(tài)

此過程為——裝配

能量來(lái)源——***

解旋酶六個(gè)單體 每個(gè)都能結(jié)合***

這意味著它（解旋酶的每個(gè)亞基）有3個(gè)狀態(tài)

1.***

2.ADP

3.不結(jié)合

這三種狀態(tài)能量是不同的

每次轉(zhuǎn)換的過程 都會(huì)有能量差 解旋酶也就是靠這個(gè)能量來(lái)打開堿基對(duì)的

它打開的是堿基對(duì)間的氫鍵

習(xí)題：

Steve Bell

需要解旋酶的原因：DNA聚合酶解旋解的太慢 大約慢10倍

• 復(fù)制解旋酶

環(huán)狀六聚體

********NA解旋

圍繞一條鏈來(lái)發(fā)揮作用 并且換一條鏈

復(fù)制解旋酶對(duì)六環(huán)外的東西毫不在意 但環(huán)內(nèi)必須為DNA

它是如何做到的呢？

Q：只能穿單鏈？

A：沒地方啦 一條鏈也很擠

Q：6個(gè)亞基不同狀態(tài)？*** ADP 沒有？

A：這六個(gè)亞基每個(gè)都是能夠結(jié)合*** 箭頭指的紅色部***/ADP的結(jié)合位點(diǎn) 當(dāng)然 并非所有亞基在任何時(shí)候***/ADP/核苷酸（即什么都不結(jié)合）

從結(jié)構(gòu)而言 這6個(gè)亞基可能是在3中狀態(tài)不斷過渡

如果過程在來(lái)一遍 6個(gè)亞基都這樣搞 DNA就會(huì)相對(duì)于解旋酶向下運(yùn)動(dòng)

這就是解旋酶工作的原理——結(jié)合、水解、釋放、向上運(yùn)動(dòng)、再次結(jié)合

在細(xì)菌里 解旋酶圍繞的是后隨鏈

在真核生物里 解旋酶圍繞的是前導(dǎo)鏈

P17 DNA解旋酶的活性及其檢測(cè)方法

生命中國(guó)的叨叨

標(biāo)記引物：

如果解旋酶有活性 那引物與模板會(huì)分開 20-25bp

如果解旋酶有活性 和模板差不多大小 約5000bp

習(xí)題：

鹽：陽(yáng)離子（帶正電）

DNA：帶負(fù)電

如果鹽離子濃度低：

變性的兩條DNA鏈 同極相斥 不容易復(fù)性（維持單鏈狀態(tài)）

如果鹽離子濃度高：

抵消一部分負(fù)電荷 兩條鏈傾向堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合（復(fù)性）

復(fù)性后無(wú)論有無(wú)解旋酶 跑膠后都是模板的位置 2000多bp

Steve Bell

解旋酶不會(huì)形成或者破壞化學(xué)鍵 所以我們無(wú)法用摻入法 不能用放射性標(biāo)記核苷酸或引物

相反我們需要觀察復(fù)制解旋酶怎么改變DNA

示意圖：

• 為什么低鹽環(huán)境有利于DNA變性？

DNA：負(fù)電

你把兩個(gè)DNA放在一塊 他們會(huì)同級(jí)相斥

體系里鹽濃度越高 斥力越小

所以鹽濃度低 不能維系退火條件（變性）

P18 DNA解旋酶的極性及其檢測(cè)方法

生命中國(guó)的叨叨

極性：方向性

極性由六聚體所結(jié)合的單鏈決定

可知：

解旋酶的極性不是固定的

結(jié)合的單鏈決定解旋酶的走向

檢測(cè)：

拿引物（大約60個(gè)標(biāo)記過的核苷酸）與模板（模板還是ssDNA）結(jié)合

結(jié)合后 結(jié)合的部分就是雙鏈 然后用內(nèi)切酶切開 兩段引物長(zhǎng)度不同（這看你切哪）

加解旋酶 跑膠 通過被標(biāo)記的部分來(lái)判斷解旋酶到底往哪邊走

Steve Bell

解旋酶重要性質(zhì)：

1.

在ssDNA的移動(dòng)方向是一定的 這就是為什么它需要能量 因?yàn)樗还庖谱逥NA 也要只向一個(gè)方向移動(dòng)

這叫做“極性”

方向可以5'→3' 也可以3'→5'

2.

解旋酶只能結(jié)合ssDNA

（沒有空間結(jié)合dsDNA）

Q：模板哪個(gè)是5'哪個(gè)是3'？

A：用引物 引物是5→3' 那么模板一定是反的 也就是3'→5'（在引物的方向看）但換一個(gè)角度 可見是5'→3'

如圖：

如何檢測(cè)解旋酶的極性？

我們需要根據(jù)酶的進(jìn)行方向不同來(lái)選擇底物

• 把引物標(biāo)記全長(zhǎng)（摻入放射性同位素或熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)）
• 然后用一個(gè)平末端限制酶切它 這個(gè)限制酶會(huì)在引物區(qū)域內(nèi)部不對(duì)稱的切割
• 限制酶切的是雙鏈而不是單鏈 要設(shè)計(jì)好 在合適的位置有酶切位點(diǎn)

解旋酶結(jié)合在沒有標(biāo)記的單鏈

之前說過細(xì)菌的解決沒在后隨鏈上移動(dòng)

移動(dòng)方向是5'→3' 如果是前導(dǎo)鏈上移動(dòng)則相反

原核細(xì)胞復(fù)制叉 圖

真核生物的酶想要在相反方向的鏈移動(dòng) 就必需有相反的極性

P19 DNA單鏈結(jié)合蛋白

生命中國(guó)的叨叨

保護(hù)：讓DNA存在 形態(tài)不確定

穩(wěn)定：存在且形態(tài)一定

若雙鏈打卡后放著 會(huì)有什么可能性？

降解、自我折疊（如果鏈內(nèi)由互補(bǔ)結(jié)構(gòu)） 、退火復(fù)性……

協(xié)同作用：

原核生物SSB一個(gè)之后 傾向于繼續(xù)結(jié)合 直到鋪滿

這種協(xié)同作用可以以1000倍的速率增長(zhǎng)

第一個(gè)SSB 1

第二個(gè)SSB 1000

第三個(gè)SSB 1000000

真核里：RPA（麩質(zhì)蛋白A）

圖：?jiǎn)捂溄Y(jié)合蛋白示意圖

Steve Bell

Q:

怎樣阻止兩條鏈迅速結(jié)合？

A：

1.前導(dǎo)鏈聚合酶能夠快速?gòu)?fù)制解旋酶后的ssDNA

2.SSB迅速結(jié)合后隨鏈模板

SSB：

-SSB能夠高親和的結(jié)合ssDNA 而不是dsDNA

-SSB能夠阻止雙鏈DNA退火

-SSB以協(xié)同結(jié)合的方式結(jié)合ssDNA

-SSB結(jié)合的DNA很容易被聚合酶復(fù)制

-SSB結(jié)合的時(shí)候 堿基仍然暴露在外

SSB吸引聚合酶 ssDNA變成dsDNA SSB的親和力也就沒有那么強(qiáng)了 所以就脫落了

還有一些理論認(rèn)為 聚合酶會(huì)對(duì)SSB脫落起到一定促進(jìn)作用

P20 DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（上）

生命中國(guó)的叨叨

只要DNA不被打開 LK是不變的

LK0是一個(gè)基準(zhǔn)

當(dāng)完全沒有超螺旋的時(shí)候 連環(huán)數(shù)由堿基對(duì)數(shù)決定

B型DNA：LK0=總堿基對(duì)數(shù)/10.4

（除于幾 是因?yàn)槊恳蝗β菪袔讉€(gè)堿基對(duì)是一定的 其他型的DNA可以看它們每一圈的固定的堿基對(duì)數(shù)）

一般細(xì)胞中DNA負(fù)超螺旋多 松弛狀態(tài)有助于貯存自由能 這個(gè)能量是用于供給拓?fù)洚悩?gòu)酶的

Steve Bell

解旋酶把DNA兩條鏈分開時(shí) 復(fù)制叉前方會(huì)積累過多的鏈結(jié)

如果強(qiáng)行分開雙鏈 那么這些纏繞著的結(jié)構(gòu)就會(huì)被壓縮到越來(lái)越小的區(qū)域 它們?cè)椒e越多 最終會(huì)導(dǎo)致復(fù)制終止

拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠讓次優(yōu)解的DNA鏈結(jié)結(jié)構(gòu)松弛

最優(yōu)解：最優(yōu)的DNA結(jié)構(gòu)是每圈螺旋包含10.4個(gè)bp 這使得DNA處于不受力的狀態(tài)

過度螺旋或正超螺旋DNA每圈<10.4bp

螺旋不足或負(fù)超螺旋DNA每圈>10.4bp

拓?fù)洚悩?gòu)酶能讓DNA盡可能地松弛下來(lái) 解開過度螺旋或螺旋不足的DNA

P21 DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（下）

生命中國(guó)的叨叨

DNA超螺旋：螺旋之螺旋

螺旋過度與螺旋不足實(shí)際上都是由完全松弛形成的

Q&A

一些定義：

LK一定是整數(shù) 而Tw可以是非整數(shù)（你纏半圈也可以的）

Wr也是超螺旋數(shù)

LK=Tw+Wr

這叫做DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA真實(shí)圖片

Steve Bell（not）

LK=Tw+Wr

一、扭轉(zhuǎn)數(shù)Tw

扭轉(zhuǎn)數(shù)是一條鏈完全纏繞零一條鏈的次數(shù)

如圖：扭轉(zhuǎn)數(shù)Tw=3 纏繞數(shù)Wr=0

二、纏繞數(shù)Wr

纏繞數(shù)是只雙螺旋自我交叉的次數(shù) 其正負(fù)取決于纏繞方向

如圖：纏繞數(shù)Wr=-1 因?yàn)樗裱沂侄▌t 上端鏈從左向右

如圖：纏繞數(shù)Wr=1

cccDNA（公家閉合環(huán)狀DNA）

跟線性DNA不同 cccDNA在形狀上收到拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的約束 這就意味著不可能在不斷鏈的情況下改變LK

但如果增加或減少雙螺旋上的Tw或Wr會(huì)發(fā)生什么呢？

• 螺旋過度的DNA每圈<10.4bp 所以它比松弛DNA纏的更緊 扭轉(zhuǎn)數(shù)和連環(huán)數(shù)更大
• DNA過度螺旋是 連環(huán)數(shù)會(huì)增加 從而使DNA正超螺旋化 雙鏈會(huì)自我纏繞形成正超螺旋
• 正超螺旋比松弛狀態(tài)擁有更高的連環(huán)數(shù) DNA的兩條鏈能難分開

• 螺旋不足的DNA每圈多>10.4bp 因此螺旋不足時(shí)的DNA會(huì)比松弛狀態(tài)更松 其扭轉(zhuǎn)數(shù)與連環(huán)數(shù)更小
• 當(dāng)DNA螺旋不足時(shí) 連環(huán)數(shù)減小 DNA形成負(fù)超螺旋 雙鏈以與正超螺旋相反的方向纏繞 而產(chǎn)生扭矩
• 負(fù)超螺旋比松弛狀態(tài)擁有更低的連環(huán)數(shù) 從而讓雙鏈更容易分開

但如果松弛是DNA約束最小的狀態(tài) 那雙螺旋是怎樣從松弛狀態(tài)變成過度螺旋或螺旋不足呢？正/負(fù)超螺旋又怎樣恢復(fù)到松弛的狀態(tài)呢？

拓?fù)洚悩?gòu)酶！

這意味著拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠吧過度螺旋的DNA放松 讓連環(huán)數(shù)減少到更合適的每圈10.4個(gè)堿基對(duì) 或讓螺旋不足的DNA重新纏繞 讓連環(huán)數(shù)增加到更合適的每圈10.4bp

拓?fù)洚悩?gòu)酶能切斷1或2條鏈 并讓相同數(shù)量的鏈穿過切口 這么做的結(jié)果是讓拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)受限的cccDNA連環(huán)數(shù)增加或是減少

拓?fù)洚悩?gòu)酶有兩類 Ⅰ型與Ⅱ型

Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶打開一條鏈 并讓另一條鏈穿過切口 這樣能讓連環(huán)數(shù)增加或減少1

Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶行使功能無(wú)需額外能量

Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶會(huì)把兩條鏈都打開 并讓整個(gè)雙螺旋穿過切口 這樣能讓連環(huán)數(shù)增加或減少2

Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)*********DH做能量

細(xì)菌也有一種特殊的Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶 叫做旋轉(zhuǎn)酶 旋轉(zhuǎn)酶通過耗能讓DNA負(fù)超螺旋化 而不是恢復(fù)松弛狀態(tài)

有些嗜熱菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶讓DNA正超螺旋化 而不是恢復(fù)松弛狀態(tài) 因?yàn)樗c旋轉(zhuǎn)酶作用相反 也叫反旋轉(zhuǎn)酶

Q:

如果DNA在松弛狀態(tài)是不受張力的 那么為什么有些生物專門產(chǎn)生酶把DNA正超螺旋化或是負(fù)超螺旋化呢？

A:

蓄熱菌和超級(jí)嗜熱菌都生長(zhǎng)在高溫環(huán)境 約45~100℃ 嗜熱菌DNA上的正超能夠增加雙螺旋的扭轉(zhuǎn)數(shù)或纏繞數(shù) 進(jìn)而增加連環(huán)數(shù)

這樣的改變會(huì)使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定 防止DNA在高溫下容易變性

實(shí)際上大多數(shù)生物的DNA都是負(fù)超 負(fù)超提供了儲(chǔ)存自由能的場(chǎng)所 這有利于細(xì)胞中需要解旋的過程 如復(fù)制與轉(zhuǎn)錄

螺旋不足的DNA有自我分離的趨勢(shì) 因此解旋比松弛態(tài)的DNA更容易

當(dāng)分開負(fù)超螺旋時(shí) DNA其他部分會(huì)產(chǎn)生更多的扭轉(zhuǎn) 會(huì)讓螺旋不足的鏈重新纏繞 而這時(shí)仍存在配對(duì)狀態(tài)的DNA會(huì)恢復(fù)到理想的松弛態(tài) 而你會(huì)得到一天可用于轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的ssDNA

如果你嘗試打開松弛的雙螺旋 結(jié)果就是過度螺旋或正超螺旋 這樣的雙螺旋在熱力學(xué)上是不穩(wěn)定的

P22 DNA的拓?fù)洚悩?gòu)酶的類型與原理

生命中國(guó)的叨叨

• 拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠破壞或連接糖-磷酸骨架 產(chǎn)生瞬時(shí)的DNA單鏈或雙鏈斷裂 從而改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

作用機(jī)理：斷開-穿過-連接

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ：

酶的酪氨酸（Tyr）羥基進(jìn)攻單鏈 和切口處的5'磷酸形成共價(jià)鍵

轉(zhuǎn)酯反應(yīng)：

酯：羥基和酸生成

酯化反應(yīng)口訣：酸脫羥基醇脫氫

這里 酪氨酸的羥基代替了3'-羥基

Topo 1-Tyr-DNA中間體：

蛋白和核酸的復(fù)合物

一般消減負(fù)超（不代表不會(huì)消減正超） 消減后LK+1

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ

Steve Bell

拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠讓DNA的一條鏈斷開 但它們?nèi)匀贿B接著斷開的DNA兩端

拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合DNA上的一個(gè)點(diǎn) 利用酪氨酸上的羥基連接DNA兩端

在這個(gè)過程中他與5'磷酸基形成共價(jià)鍵 與另一端3'羥基形成非共價(jià)鍵

接著它又使DNA重新結(jié)合

這個(gè)過程實(shí)際上是能量平衡的 所以拓?fù)洚悩?gòu)酶不需*********能源來(lái)行使功能 因?yàn)樗乃魉鶠槟茏越o自足 完全受DNA里的能量驅(qū)動(dòng) 它們也是通過這種方式感知修復(fù)DNA的—由DNA的能量狀態(tài)來(lái)確定這一點(diǎn)

切開DNA后 它們與雙鏈DNA結(jié)合 切開一條鏈 讓另一條鏈穿過切口

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷一條鏈 讓另一條鏈穿過切口

↑它也能這樣工作

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ能夠±1LK

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ：

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ能夠切斷并傳遞雙鏈并傳遞雙鏈

它切斷雙鏈 然后把它們固定住 它有2個(gè)活性位點(diǎn) 分別與兩個(gè)5'端結(jié)合 并與3'以非共價(jià)鍵方式結(jié)合 之后再通過切口把后面的雙鏈拉過來(lái) 重新連接切口

通過這一過程可以±2LK

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ還能解開兩個(gè)連環(huán)DNA

環(huán)狀DNA復(fù)制后會(huì)形成索環(huán)

當(dāng)然拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ也能做到（一條一條解）就是效率低

實(shí)際上 也許拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的出現(xiàn)最初不是為了解決拓?fù)鋵W(xué)的問題 而是為了解決環(huán)狀染色體演化之初的索環(huán)問題

P23 細(xì)菌中特殊的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ——螺旋酶

生命中國(guó)的叨叨

DNA螺旋酶目前只在細(xì)菌里發(fā)現(xiàn)

細(xì)菌的質(zhì)粒、染色體……是環(huán)狀的

復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)不可避免的產(chǎn)生正超 所以要引入負(fù)超來(lái)消減壓力

工作原理：

Gyrase-DNA復(fù)合體又是個(gè)蛋白核酸復(fù)合物

第二步是轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 不需能量

習(xí)題：

Steve Bell

DNA螺旋酶：

切斷DNA內(nèi)部的鏈結(jié) 從而導(dǎo)致螺旋不足 或讓DNA負(fù)超螺旋化

螺旋不足的DNA更容易解旋

一旦讓它松弛下來(lái) 每單位長(zhǎng)度DNA上的連環(huán)就增加了 而DNA上的應(yīng)力并沒有增加 從而使DNA更接近正確的結(jié)構(gòu)

DNA螺旋酶能促進(jìn)DNA解旋

復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始也需要它

嗜熱菌體內(nèi)有反螺旋酶

為了防止它們的DNA在95℃的環(huán)境里熔化 它們利用細(xì)胞的能量給DNA增加正超螺旋

在每種情況下 這些酶都需要能量

生物種類不同 所消耗能量的來(lái)源不同 ******DH

進(jìn)而阻止DNA在自然環(huán)境下進(jìn)行會(huì)進(jìn)行的過程

這就是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的特殊作用

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ完全不會(huì)

P24 拓?fù)洚悩?gòu)酶的檢測(cè)方法

生命中國(guó)的叨叨

瓊脂糖凝膠：半乳糖和脫水半乳糖連起來(lái)的聚合物

這種聚合物的鏈長(zhǎng)長(zhǎng)短短 高溫融了然后冷卻凝固后會(huì)形成布滿空洞的膠

跑膠時(shí)DNA就是穿過這些孔 即 電泳

電泳是帶電粒子在電場(chǎng)中向電性相反的電極運(yùn)動(dòng)的過程

帶電離子泳動(dòng)的速率叫遷移率

核酸帶負(fù)電 向正極遷移

一般來(lái)說 場(chǎng)強(qiáng)（電場(chǎng)強(qiáng)度）一定的時(shí)候 生物大分子的遷移率取決于其本身的大小和構(gòu)象

“大小”即分子量 分子量相同的時(shí)候：

超螺旋DNA的遷移率>線性DNA>開環(huán)的松弛態(tài)DNA

如何檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性？

最右邊的泳道 就是拓?fù)洚悩?gòu)酶+DNA超螺旋的結(jié)果

• 要么是完全解開形成的松弛態(tài)（即跑的最慢的那個(gè)）（一般不會(huì)出現(xiàn)完全松弛的情況）
• 要么還是完全超螺旋狀態(tài)
• 大量的都是中間態(tài)的超螺旋

補(bǔ)充：

• 非變性凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷 它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用
• 變性凝膠電泳形成所帶負(fù)電荷相對(duì)一致的非折疊衍生物 其泳動(dòng)速度主要由分子量決定

Steve Bell

我們可以利用拓?fù)洚悩?gòu)酶作用前后DNA構(gòu)象的改變來(lái)檢測(cè)

如果用非變性凝膠跑膠環(huán)狀DNA 一般來(lái)說在大腸桿菌里提的質(zhì)粒有兩個(gè)條帶

對(duì)于沒有被切割的DNA 其中一條是松弛狀態(tài)的DNA （松弛狀態(tài)的DNA是比如你在DNA一條鏈上切一個(gè)口 另外一條鏈就會(huì)很快[zizizizizi]解旋 直到達(dá)成某種平衡）

另外一條是負(fù)超螺旋DNA

（大腸桿菌里有螺旋酶 所以有負(fù)超）

超螺旋跑的比松弛狀態(tài)的DNA快

why：

非變性瓊脂糖凝膠是個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) DNA必需穿過這些結(jié)構(gòu) 所以體積越大結(jié)構(gòu)越復(fù)雜就越難通過

超螺旋結(jié)構(gòu)纏繞的越緊密 占用空間越小 就越容易通過網(wǎng)絡(luò)

而大的松弛的結(jié)構(gòu)占據(jù)空間也大 需要變形才能通過

所以松弛DNA比超螺旋DNA遷移的慢 而線性DNA遷移速度介于二者之間（方向正確遷移速度快 但它很難保持一直正確 經(jīng)常繞來(lái)繞去）

松弛的DNA有切口 這條條帶幾乎沒怎么變

超螺旋的DNA逐漸松弛 直到很接近完全松弛的狀態(tài)

檢測(cè)：

超螺旋DNA和拓?fù)洚悩?gòu)酶一起孵育 然后跑一個(gè)瓊脂糖電泳 然后用溴化乙錠染色

如何區(qū)分拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ：

在短膜蟲的生物中 它有部分DNA是kDNA kDNA都鎖在一起——索莖結(jié)構(gòu)

它只能留在加樣孔的頂部 因?yàn)樗憩F(xiàn)的像是比自己大一千倍的分子

當(dāng)你加入拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ 因?yàn)闆]有ssDNA 所以無(wú)法打開這些索莖

但加入拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ 它能迅速打開這些索莖 形成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的環(huán) 這些環(huán)能夠迅速在凝膠里遷移

就先到這了哈