●?前言

2022年1月，歐易/鹿明生物合作客戶北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉銅華教授課題組在Frontiers in Nutrition期刊發(fā)表了題為 “Mechanisms for Improving Hepatic Glucolipid Metabolism by Cinnamic Acid and Cinnamic Aldehyde: An Insight Provided by Multi-Omics?”的研究成果，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)了肉桂酸（AC）和肉桂醛（AL）在改善葡萄糖脂代謝中的特征，探究了其代謝作用機(jī)理。為預(yù)防和治療代謝紊亂等疾病提供了理論依據(jù)。

中文標(biāo)題：肉桂酸和肉桂醛改善肝葡萄糖脂代謝的機(jī)制：多組學(xué)提供的見(jiàn)解

研究對(duì)象：小鼠

發(fā)表期刊：Frontiers in Nutrition

影響因子：6.576

發(fā)表時(shí)間：2022年1月11日

合作單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)健康培養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京中醫(yī)藥大學(xué)健康栽培北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)技術(shù)系

運(yùn)用組學(xué)關(guān)鍵技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組學(xué)、DIA蛋白組學(xué)、PRM靶向蛋白驗(yàn)證(皆由歐易/鹿明生物提供技術(shù)支持)

●?研究背景

近年來(lái)，由于葡萄糖、脂質(zhì)和能量代謝的破壞而導(dǎo)致的糖尿病等代謝性疾病患者數(shù)量的上升加劇了醫(yī)療保健系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)壓力，這對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大威脅。因此，尋找預(yù)防和治療葡萄糖脂代謝紊亂的新策略成為一個(gè)重要的研究課題。葡萄糖脂代謝的發(fā)生可歸因于許多病原體。胰島素抵抗、炎癥、線粒體功能障礙、自噬破壞以及腸道微生物群重建都可能導(dǎo)致代謝紊亂。而肝臟作為一種重要的代謝器官，在調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝中起著核心作用。

目前，改善飲食被認(rèn)為是最安全有效的治療和預(yù)防代謝性疾病的方法，其中肉桂（主要是肉桂屬植物八角肉桂和桂皮）及其成分被證明具有多種治療作用，包括抗糖尿病、減輕體重、低脂血癥和增強(qiáng)胰島素敏感性。因此，使用膳食補(bǔ)充劑和來(lái)自肉桂的化學(xué)物質(zhì)來(lái)控制血糖和血脂可能成為治療代謝類疾病的新方法。

●研究思路

● 實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組

(1) 肉桂酸組:按照體重20 mg/kg的量每天使用AC?

(2) 肉桂醛組:按照體重20 mg/kg的量每天使用AL

(3) 對(duì)照組:每天正常喂食

(4) 正常組:每天正常喂食

2.胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

治療4周后進(jìn)行ITT實(shí)驗(yàn)

3.生化測(cè)量

ITT實(shí)驗(yàn)后3天處死小鼠，收集血清標(biāo)本。檢測(cè)血糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清中葡萄糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、測(cè)定游離脂肪酸(FFA)和血尿素氮(BUN)。

比色法測(cè)定ATP，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清素含量

4.形態(tài)學(xué)評(píng)估

組織切片，蘇木精-伊紅染色

5.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及差異表達(dá)基因分析

6.實(shí)時(shí)定量PCR

7.DIA蛋白質(zhì)組學(xué)、PRM蛋白靶向驗(yàn)證

● 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1. AC和AL對(duì)小鼠葡萄糖脂代謝的影響

對(duì)照組中的Db / db小鼠血糖水平和體重與正常組相比明顯更高（圖1C，D），為嚴(yán)重葡萄糖脂代謝受損。與之相比，利用AC和AL治療4周后的 db / db小鼠的高血糖和肥胖得到明顯改善。這說(shuō)明兩種化學(xué)物質(zhì)都顯著抑制了db / db小鼠體重的增加（圖1D，E）。治療四周后進(jìn)行的ITT實(shí)驗(yàn)評(píng)估了db / db小鼠的基線血糖水平，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)治療后的db / db小鼠對(duì)皮下注射的胰島素更敏感（圖1F，G）。同時(shí)，AC處理顯著減少了db/db小鼠的肝臟重量，降低了肝臟指數(shù)。AL處理雖然也有改善但不顯著（圖1H，I）。治療組的AST，ALT和BUN水平顯著降低，表明口服AC或AL可以改善db / db小鼠的腎功能和肝功能異常（圖1P-R）。

圖1 | AC和AL對(duì)小鼠葡萄糖脂代謝的影響

2. 組織學(xué)觀察

對(duì)照組小鼠的HE染色顯示肝臟中發(fā)生了嚴(yán)重的肝臟脂肪變性。AC和AL減少了脂質(zhì)積累并部分恢復(fù)了破壞的肝索結(jié)構(gòu)（圖2A）。定量分析顯示，治療組的脂肪變性等級(jí)明顯低于對(duì)照組（圖2D）。與觀察到的附睪脂肪重量變化一致，附睪脂肪組織的組織學(xué)觀察表明，與正常組相比，db / db小鼠的脂肪細(xì)胞顯著擴(kuò)張，AC和AL減小了擴(kuò)張的脂肪細(xì)胞的大?。▓D2B，E）。肝臟的染色表明治療后肝糖原含量增加（圖2C）。

圖2 | 組織學(xué)觀察。

（A）從小鼠收獲的肝臟組織的HE染色。

（B）小鼠附睪脂肪（左側(cè)）的HE染色。

（C）小鼠肝臟的染色。所有圖像均在200×放大倍率下錄制。

（D）脂肪變性等級(jí)分?jǐn)?shù)的肝臟HE染色。

（E）從附睪脂肪HE染色中測(cè)量的脂肪細(xì)胞大小。

3. 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究

采用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析，研究了AC和AL對(duì)db/db小鼠的影響。轉(zhuǎn)錄組分析共鑒定出16812種不同的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本。其中，2837個(gè)（約16.9%）在正常組和對(duì)照組之間有顯著差異，表明db / db小鼠在轉(zhuǎn)錄水平上與野生型小鼠顯著不同。與對(duì)照組相比，共有3749個(gè)基因因攝入AC而發(fā)生顯著改變（2201個(gè)下調(diào)，1548個(gè)上調(diào)），560個(gè)基因（430個(gè)下調(diào)，130個(gè)上調(diào)）因攝入AL而發(fā)生顯著改變（圖3B）。

DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出2729種蛋白質(zhì)。正常組和對(duì)照組之間共發(fā)現(xiàn)1059個(gè)（約占總鑒定蛋白質(zhì)的38.8%）DEPs，AC處理有230個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生顯著變化（109個(gè)上調(diào)，121個(gè)下調(diào)），AL處理有211個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生顯著變化（116個(gè)上調(diào)，95個(gè)下調(diào)）（圖3C）。

圖3 | 小鼠肝臟的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組以及差異表達(dá)基因（DEGs）和差異表達(dá)蛋白（DEPs）的功能富集分析。

4. DEG 和 DEP 的功能注釋和擴(kuò)充分析

通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組db / db小鼠與正常組wt / wt小鼠之間的葡萄糖脂和能量代謝途徑存在顯著差異。雙餅環(huán)圖顯示，AC和AL顯著改變了代謝途徑中的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)。兩種處理在分子機(jī)制上顯示出相似的模式，并且大一部分DEGs和DEPs與代謝過(guò)程有關(guān)（圖3D）。DEPs中GO的富集表明，AC和AL特別調(diào)控脂質(zhì)代謝，包括脂肪酸代謝、長(zhǎng)鏈脂肪酸和膽固醇的運(yùn)輸以及HDL顆粒清除（圖3E）。值得注意的是，大量DEPs富集在線粒體等細(xì)胞器中，這些細(xì)胞器是多種代謝途徑和維持能量平衡所必需的。

5. AC和AL對(duì)參與葡萄糖脂代謝的關(guān)鍵因素的影響

蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析鑒定出了幾種參與肝葡萄糖脂代謝的蛋白質(zhì)（ACC、FASN、SCD1、CPT1A、GLUT2、GK、GS、G6Pase、PEPCK）。此外，AC顯示出抑制脂肪生成酶（ACC，F(xiàn)ASN和SCD1）表達(dá)的趨勢(shì)，同時(shí)顯著上調(diào)了GLUT2。與對(duì)照組相比，AC顯著增加了PEPCK的表達(dá)，兩種化學(xué)物質(zhì)對(duì)G6Pase均無(wú)顯著影響（圖4A）。PRM蛋白靶向驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果與蛋白質(zhì)組變化相一致，這進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖4B）。

圖4 | AC和AL對(duì)參與葡萄糖脂代謝的關(guān)鍵因素的影響。

6. AC和AL改善了db/db小鼠的線粒體功能

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析結(jié)果顯示AC和AL顯著改善了線粒體功能。GSEA分析顯示，處理組的氧化磷酸化（OXPHOS）通路顯著上調(diào)，AC組和AL組的富集得分分別為0.826和0.535（圖5A）。熱圖顯示，AC或AL處理后，OXPHOS中涉及的復(fù)合物的許多基因和蛋白都上調(diào)了（圖5B）。通過(guò)PRM蛋白靶向驗(yàn)證檢測(cè)了其中一些蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明除了NDUFS4之外，大多數(shù)結(jié)果與蛋白質(zhì)組一致（圖5C）。

根據(jù)這一證據(jù)，作者認(rèn)為AC和AL治療可以通過(guò)增強(qiáng)OXPHOS功效來(lái)改善線粒體功能（圖5D）。但是，處理組的ATP含量顯著低于對(duì)照組（圖5E）。OXPHOS過(guò)程產(chǎn)生ATP以便為生命活動(dòng)提供能量。作者假設(shè)這是因?yàn)樵贏C和AL組中，ATPases被上調(diào)（圖6A，B），消耗了產(chǎn)生的ATP。

圖5 | AC和AL改善了db / db小鼠的線粒體功能。

7. AC和AL對(duì)色氨酸代謝的影響

生物信息學(xué)分析表明，色氨酸代謝途徑中DEGs和DEPs顯著富集，AC和AL顯著提高了色氨酸代謝的基因和蛋白表達(dá)。AC和AL都顯著上調(diào)IDO2，MAOB，ALDH7A1，并且AL也顯著誘導(dǎo)IDO1和KYAT1（圖6C，D）。大部分色氨酸被代謝為犬嘌呤，最終形成NAD+（48），參與能量代謝。通過(guò)對(duì)小鼠肝臟中血清素含量的ELISA測(cè)定，AC和AL都顯著降低了db / db小鼠中血清素含量（圖6E）。結(jié)合以上證據(jù)，說(shuō)明這兩種化學(xué)物質(zhì)可以調(diào)節(jié)色氨酸的代謝，特別是增加肝臟中血清素的降解（圖6F）。

圖6 | AC和AL對(duì)db / db小鼠肝臟色氨酸代謝的影響。

8. AC和AL對(duì)自噬介導(dǎo)脂清除的影響

自噬過(guò)程使細(xì)胞能夠循環(huán)利用必要的細(xì)胞成分和適應(yīng)應(yīng)激條件。肥胖和糖尿病患者的自噬進(jìn)程會(huì)下降。文中組學(xué)結(jié)果表明，AC和AL可能會(huì)影響小鼠肝細(xì)胞的自噬。大量的DEG在吞噬體，內(nèi)吞作用和溶酶體中富集。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，AC顯著上調(diào)了脂質(zhì)代謝有關(guān)基因（LDLR，SRB1，SEC61A1和MRC1）。AL顯著增加了LDLR，LRP1，Cathepsin S（圖7A，B）和vATPase（ATP6V1C1）、（圖6A，B）的表達(dá)，它們與LDL清除率和吞噬體形成相關(guān)。之后作者進(jìn)一步確認(rèn)了脂蛋白的組成，結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致。在AC組和AL組中，APOA2和APOE的含量顯著降低（圖7A）。這些結(jié)果表明，自噬介導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)清除在治療小鼠中恢復(fù)（圖7C）。

圖7 | AC和AL對(duì)自噬介導(dǎo)的脂質(zhì)清除的影響

● 研究結(jié)論

綜上所述，AC和AL治療4周后均能改善db/db小鼠的代謝紊亂狀況。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析作者也確定了幾種可能的治療機(jī)制， AC和AL由于它們?cè)隗w內(nèi)的代謝特性而在分子機(jī)制上有很多共同點(diǎn)：（1）改善線粒體功能，特別是改善OXPHOS過(guò)程；（2）增加色氨酸代謝，降低血清素水平；（3）改善自噬，加速含TG和膽固醇的脂質(zhì)清除。因此為后續(xù)研究AC和AL預(yù)防和治療代謝性疾病開(kāi)拓了新的思路。

參考文獻(xiàn)

Fabbrini E, Sullivan S, Klein S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. (2010) 51:679–89. doi: 10.1002/hep.23280

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肉桂作為一種天然產(chǎn)品，其內(nèi)兩種重要的化學(xué)物質(zhì)（AC和AL）對(duì)抗糖尿病、減輕體重、低脂血癥和增強(qiáng)胰島素敏感性等方面具有一定的作用。文章作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合技術(shù)對(duì)db/db小鼠肝組織進(jìn)行了研究，分析了AC和AL對(duì)db / db小鼠葡萄糖脂代謝等方面的影響。研究結(jié)果表明，經(jīng)AC和AL治療4周后，db/db小鼠的代謝紊亂狀況得到改善。本文研究體現(xiàn)了組學(xué)技術(shù)在機(jī)制研究中的重要作用。

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文末看點(diǎn)

｜lumingbio

在獲得AFADESI平臺(tái)原創(chuàng)團(tuán)隊(duì)全力支持下，截止2021年9月，鹿明生物已經(jīng)完成共計(jì)近千例樣本經(jīng)驗(yàn)，包括心臟、腦、腫瘤、腸道、肝臟、腎臟、皮膚等十幾種組織樣本空間代謝組學(xué)檢測(cè)及分析，檢測(cè)物質(zhì)涵蓋膽堿類、多胺類、氨基酸類、肉堿類、核苷類、核苷酸類、有機(jī)酸類、碳水化合物類、膽固醇類、膽酸類、脂質(zhì)類等多種類代謝物。

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