近年來乳腺癌的基因組分型取得了進(jìn)展，乳腺癌的基因組分類器（如基于RNA的PAM50）被越來越多地用作識別乳腺癌分子亞型和推薦臨床使用的生物標(biāo)志物的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于乳腺癌高度異質(zhì)性的存在，其仍然還有許多局限性，而且目前的臨床診斷和治療決策通常是基于蛋白質(zhì)水平的信息。

加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)的研究團(tuán)隊于2022年3月7日在Nature Communications發(fā)表了題為“Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes”的論文。研究人員對來自于兩個隊列的300例FFPE乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以臨床適用的方式描述了乳腺癌的異質(zhì)性，確定了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點，并為臨床乳腺癌的分型提供了參考。

樣本選擇

實驗組：兩組乳腺癌診斷患者隊列2008-2013年（n=178）和1986-1992年（n=122），共300例FFPE乳腺癌標(biāo)本。樣本中PAM50的四個分型（Basal-like、Her2-enriched、LumA、LumB）各75例，其中08-13隊列包括由IHC檢測確定為TNBC（三陰性乳腺癌）的88例病例，各隊列樣本的PAM50亞型分布見下圖。

正常組：來自乳腺縮小術(shù)的正常乳腺組織樣本38例。

研究思路

研究人員使用了高靈敏度的基于MS分析的蛋白組學(xué)方法，采用優(yōu)化的FFPE標(biāo)本微量蛋白質(zhì)組處理SP3-CTP工作流程和TMT定量標(biāo)記技術(shù)。

研究結(jié)果

01FFPE?乳腺癌組織樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和研究隊列的特征

蛋白質(zhì)組學(xué)分析共定量了9088個蛋白，其中4214個蛋白在所有樣本中共有的。其中08-13隊列的病例包含所有的75例基底樣和88例由IHC檢測確定為TNBC（三陰性乳腺癌）的病例，因此該隊列是研究的重點，其中88例TNBC作為單獨的一個隊列進(jìn)行分析。

研究人員檢測了?08-13?隊列中蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和?PAM50?分類之間的重疊；觀察到基底樣亞型的良好分離，而管腔A型、管腔B型和HER2富集型亞型聚集在一起（圖?1a）。為了識別不同的基于蛋白質(zhì)的亞型，研究人員對高度變化的蛋白質(zhì)（n?=?1054）進(jìn)行了無監(jiān)督一致性聚類確定了四個穩(wěn)健分離的組。這四個基于蛋白質(zhì)組的聚類部分概括了基于RNA?的PAM50?亞型（圖?1b，c）。值得注意的是，72/73基底樣PAM50腫瘤又進(jìn)一步被細(xì)分在亞型2和亞型3（圖?1b，c），其中亞型3?顯示出最佳的無復(fù)發(fā)生存期（RFS）和總生存期（OS），而亞型2的結(jié)果最差。緊接著對08-13隊列蛋白質(zhì)組亞型3進(jìn)行差異蛋白功能分析，結(jié)果顯示大量蛋白參與免疫應(yīng)答相關(guān)通路。而在亞型2的差異蛋白功能分析中發(fā)現(xiàn)其主要在基質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）富集，與DNA復(fù)制和修復(fù)等功能相關(guān)，在免疫應(yīng)答相關(guān)的通路上則是低表達(dá)。

02關(guān)鍵亞型特異性乳腺癌蛋白的表達(dá)與亞型的生物學(xué)特征一致

研究人員分析了乳腺癌生物標(biāo)志物的蛋白豐度包括49個PAM50蛋白，是否與每個亞型的生物學(xué)特征相一致。在亞型2中，基底細(xì)胞角蛋白(KRT5、KRT17、KRT14)高表達(dá)，增殖標(biāo)志物MKI67在亞型2中較高，而在亞型4中較低（圖2）。管腔型生物標(biāo)志物包括ESR1、FOXA1和KRT18在亞型3中顯著降低，但在亞型1和亞型4中顯著升高。Her2生物標(biāo)志物(ERBB2，GRB7)在亞型1中顯著升高。PRKDC是CPTAC(臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)盟)報道的一個基底樣亞型特異性生物標(biāo)志物在亞型2中顯著升高。

03三陰性乳腺癌由四個臨床上不同的蛋白亞型組成

PAM50基底樣亞型在臨床上近似于TNBC（三陰性乳腺癌）IHC狀態(tài)。研究人員分析了88例均在08-13個隊列中的，且由IHC定義的TNBC病例(通過基于RNA的PAM50分析為：61個基底樣病例，22個HER2富集病例，5個管腔B病例)。對最高變化蛋白(n=1055)無監(jiān)督聚類分析確定了4個穩(wěn)健的聚類（圖3a），其RFS和OS的預(yù)后有顯著差異。TNBC-亞型1主要由基底樣病例組成，與其他亞型相比具有最好的生存率。

TNBC-亞型1病例TIL含量高，TAP1和HLA-DQA1表達(dá)高，因此稱為基底免疫熱型。TNBC-亞型2主要是基底樣病例在ECM、凝血和體液免疫反應(yīng)中表達(dá)豐富，其中CLDN3?和分化的管腔細(xì)胞表面標(biāo)志物?MUC1?和?EPCAM32?的顯著低表達(dá)；因此稱為間充質(zhì)細(xì)胞。TNBC-亞型3?主要是?PAM50的?Her2- Enriched病例，該亞型高表達(dá)管腔細(xì)胞角蛋白?7、8、18、19?和催乳素誘導(dǎo)蛋白（PIP）；即命名管腔。TNBC-亞型4?都是基底樣病例，生存期最差，富集了?DNA?復(fù)制和細(xì)胞周期蛋白，幾乎沒有免疫相關(guān)的肽和極少的?TIL；因此稱為基底免疫冷。

04蛋白質(zhì)組學(xué)特征揭示管腔乳腺癌的生物學(xué)異質(zhì)性

86-92個隊列中的110個樣本進(jìn)行一致性聚類分析得到三個主要的亞型（圖4）。86-92亞型1和2主要是管腔A型，86-92亞型3主要是管腔B型。亞型1中RNA處理和剪切過程的蛋白高表達(dá)，但是缺乏參與抗原處理和提呈以及I型和II型IFN信號的免疫相關(guān)蛋白。亞型2富集基質(zhì)蛋白和ECM成分，包括一些膠原蛋白成員（稱為管腔A基質(zhì)富集）。亞型3高表達(dá)和DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、DNA損傷反應(yīng)和免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白，包括MHCI類抗原加工和呈遞，以及T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與亞型1和2相比，參與ECM、凝血、上皮細(xì)胞分化和對雌激素和類固醇激素反應(yīng)的相關(guān)蛋白是降低的。

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此外，研究人員試圖通過將單個蛋白的持續(xù)增加和RFS關(guān)聯(lián)起來，在10年或更長時間的長期隨訪中確定可能與他莫昔芬獲益或耐藥性相關(guān)的單個候選蛋白。多重校正測試確定脂肪酸結(jié)合蛋白7（FABP7）是與他莫昔芬治療后與RFS>10年相關(guān)的唯一候選生物標(biāo)志物。

總結(jié)

研究人員對FFPE標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，結(jié)合相關(guān)的結(jié)果數(shù)據(jù)，以一種可靠且臨床適用的方式表征了乳腺癌的異質(zhì)性。免疫差異、細(xì)胞外基質(zhì)和脂質(zhì)代謝途徑的研究結(jié)果具有潛在的臨床相關(guān)性。此外，本研究確定了用于深入分析現(xiàn)有存檔的臨床試驗FFPE標(biāo)本的候選蛋白質(zhì)，為開發(fā)乳腺癌的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物提供了寶貴的資源。

利用蛋白組學(xué)研究具有不同生存結(jié)果的乳腺癌亞型

期刊名稱：Nature Communications

影響因子：12.121

樣本選擇：300?例確診患者的FFPE?乳腺癌手術(shù)標(biāo)本

技術(shù)策略：TMT蛋白質(zhì)組學(xué)