多年以前，

孔子就說過

“唯女子與小人難養(yǎng)也，

近之則不遜，

遠之則怨。”

其實他不知道，

那是因為

”女子“與”小人“身上

都有著同一種東西，

那就是

細胞!!!

”女子“與“小人”之所以難養(yǎng)，

是因為細胞很難養(yǎng)！??！

不信？

看我們星爺?shù)谋砬椤?/p>

↓

養(yǎng)細胞可不是

撒金錢花時間再加甜言蜜語

就可以搞定的。

也許你養(yǎng)了很長時間，

還是發(fā)現(xiàn)以下這種圖

↓

永遠都是別人家的！

沒關系，

這里有絕招。

首先我們需要了解一下什么是

細胞培養(yǎng)技術

細胞培養(yǎng)技術實際上就是細胞克隆技術：模擬體內(nèi)環(huán)境，在無菌條件下，給予適當?shù)臏囟群退釅A度以及細胞生長繁殖所需的營養(yǎng)條件，使其能在體外維持生長繁殖并保持其結構和功能。

細胞培養(yǎng)技術的應用十分廣泛，包括基礎醫(yī)學研究、抗體制備、新藥篩選和基因工程等。

之所以做起來比說起來難，

主要是因為有一門技術特別關鍵，它就是：

?無菌技術

要掌握無菌技術，

需要注意以下幾點：

細胞培養(yǎng)房應有一個單獨的體系，所有細胞房使用的耗材試劑都應該是經(jīng)過高溫滅菌的。

現(xiàn)在一般都直接購買無菌的培養(yǎng)基、血清、PBS、一次性的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿、一次性的離心管，這在一定程度上大大減少了培養(yǎng)細胞所耗費的人力和可能因為滅菌不徹底所帶來的污染。

實驗人員應穿戴整齊帽子、口罩、潔凈服、手套、鞋套才能進入細胞房。

超凈工作臺使用前應照射30 min紫外以消毒，盡量減少拿進超凈臺的物品，培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿進超凈臺后可用酒精棉球擦拭，實驗人員的手套也需要經(jīng)常噴酒精以消毒。

實驗過程中勤換槍頭，一經(jīng)污染立即丟棄。

實驗結束后，移走所有物品，用消毒酒精擦拭工作臺面并照射30 min紫外以消毒。

當天實驗垃圾當天處理，不留在細胞房過夜。

無菌技術學到手以后，

以下幾種就容易多了：

原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)是指從組織分離細胞之后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段。此法用于分離并培養(yǎng)特定的所需要的細胞。

細胞復蘇

細胞復蘇是將凍存在液氮中的的細胞重新培養(yǎng)。

復蘇流程

凍存于液氮中的細胞在37℃水浴鍋中快速凍融，吸到一個無菌的15 ml離心管中，加入4 ml培養(yǎng)基，1000 g離心5 min，棄去上清，加入5 ml完全培養(yǎng)基輕輕將細胞沉淀吹打均勻，再將細胞懸液吸取到一個新的無菌培養(yǎng)瓶/皿中，并補加適量培養(yǎng)基，推勻，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

細胞傳代

細胞培養(yǎng)到一定的時候需要換液和傳代，以免營養(yǎng)成分不夠影響細胞生長，或者因細胞生長過于密集而導致細胞出現(xiàn)衰退和分化。一旦細胞生長狀態(tài)變差將很難扭轉和補救。并且，每天都應該用肉眼觀察培養(yǎng)箱水盤和二氧化碳壓力表，培養(yǎng)基的顏色是否澄清透明，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長速度是否正常。一般貼壁細胞生長到85-90%就需要進行細胞傳代了。

傳代流程

棄去培養(yǎng)瓶/皿中的培養(yǎng)液，用無菌PBS洗2次，棄去PBS，加入適量胰酶，放入培養(yǎng)箱中孵育幾分鐘（不同細胞消化時間不一樣），輕輕拍打使細胞完全脫落。立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并用一次性槍頭輕柔的吹打均勻，將細胞吹打成單個細胞。此時的細胞懸液移到另一無菌15 ml離心管中，取100微升用于計數(shù)，其余的1000 g 5 min離心。離心結束后棄上清，在離心管中加入適量PBS重懸，得到的細胞懸液可用于細胞傳代，細胞傳代比例一般是1:3-1:5；或者根據(jù)計數(shù)結果鋪板進行其他實驗。懸浮細胞的操作方法同貼壁細胞類似，區(qū)別只是在于用15 ml或者50 ml離心管收集細胞懸液并離心和計數(shù)后即可對細胞進行傳代或其他實驗操作。

細胞計數(shù)流程

在100微升的細胞懸液中加入10微升的臺盼藍染液，混勻，取10微升加入細胞計數(shù)板中進行計數(shù)。4個大方格的細胞數(shù)除以4再乘以1.1再乘以104，所得數(shù)值即為細胞密度。

細胞凍存

細胞凍存和細胞復蘇過程中對細胞傷害最大的是細胞內(nèi)的水形成的冰晶，所以采取慢凍快融以盡量減少冰晶的形成。細胞凍存可以直接買商品化的凍存液也可自行配制。10%DMSO+90%FBS，混勻4度保存可放置一個月。

凍存流程

貼壁或者懸浮培養(yǎng)的細胞經(jīng)胰酶消化成單個細胞后用含有血清的培養(yǎng)基終止消化，1000 g離心5 min，棄去上清，用PBS洗2次，最后在細胞沉淀中加入1 ml凍存液，重懸，并將細胞懸液加入到凍存管中，在凍存管的管壁上做好標記如細胞名稱，時間，凍存人，將凍存管放入程序降溫盒，置于-80℃，過夜后放入液氮罐即可。

常見問題

細胞培養(yǎng)最常見的問題是污染。

微生物污染

表現(xiàn)是培養(yǎng)液由澄清透明變渾濁，鏡下觀察可見異常不明顆?；蛘呔z體。對于發(fā)生微生物（細菌，酵母）污染的細胞除非是特別珍貴的細胞，否則一般不建議用抗菌藥物殺滅細菌或酵母，應予以丟棄。若一定要保留被污染的細胞，則可用PBS反復洗滌，再加入抗菌藥，并勤換培養(yǎng)液。注意與其他未污染的細胞所使用的東西分隔開，最好單獨一個生物安全柜。

支原體污染

細胞突然變得生長速度緩慢或者死亡，懸浮細胞則發(fā)生聚集。支原體污染的細胞可用殺死支原體的藥物處理，一般經(jīng)過處理幾天后情況會有所好轉。

病毒污染

一般發(fā)生病毒污染的細胞很難被檢測出來，不過即使有病毒污染也不會對實驗結果產(chǎn)生影響，一般不必理會。

細胞培養(yǎng)避免污染的的重中之重在于預防。細胞房應每周徹底清潔一次，所用物品和耗材應嚴格滅菌，實驗人員應嚴格無菌操作。