寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院團(tuán)隊(duì)在2014年4月發(fā)表于Cell Research（IF：17.916，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊是Jun Cui教授和Rong-Fu Wang教授，研究表明USP3通過(guò)去泛素化RLRs在I型IFN信號(hào)通路與抗病毒免疫中起負(fù)調(diào)控作用。

研究背景

????????I型干擾素（(包括IFN-α和IFN-β)）是病毒清除的關(guān)鍵，嚴(yán)格調(diào)控I型IFN信號(hào)對(duì)于維持先天性和獲得性免疫的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。泛素化的翻譯后修飾在先天免疫信號(hào)的正負(fù)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。? ? ?

????????RIG-I和MDA5作為胞質(zhì)RNA感受器，在刺激后招募線粒體蛋白MAVS。MDA5與RIG-I具有相同的結(jié)構(gòu)域，其中CARDs用于結(jié)合MAVS，而CTD用于結(jié)合dsRNA。結(jié)構(gòu)分析表明，RIG-I在沒(méi)有病毒RNA時(shí)通過(guò)CARD和CTD的分子內(nèi)相互作用而自我抑制。RIG-I的激活需要RNA結(jié)合與K63連接的多泛素鏈。TRIM25和RNF135已被確定為介導(dǎo)RIG-I上K63-多泛素化的E3泛素連接酶。然而，對(duì)其去泛素化的分子機(jī)制仍知之甚少。

摘要部分

????????去泛素酶USP3已被鑒定為一種染色質(zhì)修飾物，可維持基因組的完整性，但它是否參與先天免疫信號(hào)尚不清楚。作者報(bào)道了USP3通過(guò)靶向RIG-I抑制I型IFN信號(hào)通路的激活。USP3的敲低特異性增強(qiáng)了RIG-I的K63-泛素化，上調(diào)了IRF3磷酸化，并促進(jìn)了I型IFN細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抗病毒免疫。作者進(jìn)一步證明，在病毒感染或配體刺激下，USP3通過(guò)K63連接的多泛素鏈與RIG-I特異性結(jié)合并將其移除。作者的研究確定了USP3在RIG-I激活中的作用，并闡明了USP3抑制RIG-I信號(hào)傳導(dǎo)和抗病毒免疫的相關(guān)機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容

1.USP3負(fù)調(diào)控I型IFN信號(hào)? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)，USP3顯著抑制了刺激誘導(dǎo)的IFN-β熒光素酶報(bào)告基因（IFN-β-luc）的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，USP3顯著抑制所有刺激誘導(dǎo)的ISRE-luc，但僅部分抑制NF-κB-luc的激活，這表明USP3直接且主要抑制IFN-β信號(hào)。? ? ?

????????接著作者檢測(cè)轉(zhuǎn)染了Myc-USP3或內(nèi)源USP3的293T細(xì)胞中IRF3的磷酸化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Myc標(biāo)記或未標(biāo)記的USP3對(duì)ISRE激活均表現(xiàn)出類(lèi)似的抑制作用。此外，Myc-USP3明顯抑制了由不同刺激誘導(dǎo)的內(nèi)源性IRF3磷酸化。

????????病毒感染的實(shí)驗(yàn)顯示，24h后對(duì)照組有30.6％的細(xì)胞被感染，而轉(zhuǎn)染USP3的細(xì)胞中高達(dá)87.6％被感染。這說(shuō)明USP3的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致病毒感染的細(xì)胞明顯增多。

研究結(jié)論：USP3的過(guò)表達(dá)抑制I型IFN應(yīng)答，從而減弱抗病毒免疫。

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2.USP3的敲低促進(jìn)RLR介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)??? ?

????????接著作者探究USP3下調(diào)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子IRF3磷酸化（p-IRF3）的影響。結(jié)果顯示，在poly(I:C)和poly(dA:dT)處理或VSV感染條件下,USP3敲低的細(xì)胞中p-IRF3比對(duì)照細(xì)胞至少高了3倍。研究表明，USP3的下調(diào)顯著增強(qiáng)了刺激后293T中IRF3的磷酸化。? ? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)下調(diào)USP3還顯著增加了刺激后293T中ISRE-luc和NF-κB-luc的活性。與該結(jié)果一致，敲低USP3顯著提高了IFN-β或IFN刺激的細(xì)胞因子（如IFIT2和CCL5）的mRNA水平。這表明USP3下調(diào)可促進(jìn)IFN-β的激活和IFN誘導(dǎo)的基因表達(dá)。

????????作者敲低了293T中的USP3，然后用VSV-eGFP感染細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)。感染后16-24 h，USP3的敲低使細(xì)胞對(duì)病毒感染具有抵抗力，且病毒感染的細(xì)胞明顯減少。

研究結(jié)論：USP3特異性的敲低顯著增強(qiáng)了I型IFN應(yīng)答和抗病毒免疫。

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3.USP3通過(guò)靶向RIG-I和MDA5抑制I型IFN信號(hào)??? ?

????????作者制備了包含CARD的N端RIG-I或N端MDA5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們可以強(qiáng)烈激活I(lǐng)SRE-luc，但增加USP3的量可以抑制這種激活，表明USP3直接抑制了RIG-I和MDA5上CARD的功能。? ?

????????進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，USP3的敲低增強(qiáng)了RIGI（N）和MDA5（N）誘導(dǎo)的ISRE-luc或IFN-β-luc活性，但不能增強(qiáng)MAVS、TBK1或IRF3誘導(dǎo)的激活。

????????此外，USP3的過(guò)表達(dá)抑制了RIG-1（N）或MDA5（N）誘導(dǎo)的IRF3磷酸化，但不能抑制MAVS或IRF3誘導(dǎo)的磷酸化，而USP3的敲低具有相反作用。此外，USP3可抑制RIG-I誘導(dǎo)的I型IFN信號(hào)，但不能抑制MAVS誘導(dǎo)的I型IFN信號(hào)。

研究結(jié)論：USP3通過(guò)RLRs直接抑制IRF3磷酸化和I型IFN信號(hào)。

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4.配體刺激后USP3與RIG-I和MDA5相互作用? ? ?

????????實(shí)驗(yàn)表明，USP3在未刺激的細(xì)胞中不與RIG-I相互作用，但在配體刺激后與RIG-I相互作用。同樣，配體刺激后USP3與MDA5相互作用。相反，未發(fā)現(xiàn)USP3與其他下游信號(hào)蛋白存在相互作用。? ? ?

????????作者還發(fā)現(xiàn)USP3在未刺激的THP-1細(xì)胞中同樣不與RIG-I、MDA5相互作用。但在相應(yīng)的配體刺激下，USP3可分別與RIG-I、MDA5相互作用。

????????接下來(lái)作者探究在RLRs中與USP3相互作用的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示USP3與全長(zhǎng)RIG-I的相互作用較弱，與RIG-I（N）的相互作用較強(qiáng)。MDA5的實(shí)驗(yàn)得到了相似結(jié)果。因此，USP3與RIG-1或MDA5中的CARD發(fā)生特異性相互作用。

研究結(jié)論：USP3以配體依賴(lài)的方式與RIG-I或MDA5相互作用，并且USP3僅在RLRs暴露出CARD時(shí)與之結(jié)合。

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5.USP3介導(dǎo)去除RIG-I上K63連接的多泛素鏈??? ?

????????實(shí)驗(yàn)顯示，poly（I:C）（LMW）刺激4-8 h后，293T中RIG-I的K63位被高度泛素化。而USP3的過(guò)表達(dá)顯著抑制這一泛素化。與此一致，USP3的敲低促進(jìn)了配體刺激后RIG-I上的K63-泛素化。作者還觀察到過(guò)表達(dá)USP3對(duì)MDA5泛素化具有類(lèi)似的抑制作用。

????????另外，作者還敲除了THP-1細(xì)胞中的內(nèi)源性USP3。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染USP3 siRNA的細(xì)胞中RIG-I的K63-多泛素化水平增加，并且這種增加與IRF3的磷酸化增強(qiáng)相關(guān)。此外，將泛素化的RIG-1或MDA5與純化的USP3蛋白共同孵育會(huì)降低它們的多泛素鏈水平。

研究結(jié)論：USP3可直接切除RLRs上K63連接的多泛素鏈，從而抑制IFN-β信號(hào)。

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6.USP3的去泛素化活性需要鋅指Ub結(jié)合域和USP催化域? ? ?

????????USP3包含兩個(gè)保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域：鋅指Ub結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ZnF)和USP催化結(jié)構(gòu)域（UCH）。作者發(fā)現(xiàn)，雖然USP3的ZnF結(jié)構(gòu)域本身不能抑制RIG-I誘導(dǎo)的I型IFN激活，但UCH結(jié)構(gòu)域可能需要它才能達(dá)到最大的催化活性。

????????作者構(gòu)建了UCH被破壞的USP3突變體（C168S）和ZnF被破壞的USP3突變體（H56A）。實(shí)驗(yàn)顯示，USP3（C168S）和USP3（H56A）突變體均不能從RIG-I中去除K63連接的多泛素鏈，表明RIG-I的去泛素化需要USP3上完整的ZnF和催化結(jié)構(gòu)域。作者進(jìn)一步確定了上述兩種突變均消除了USP3對(duì)I型IFN信號(hào)的抑制作用。

研究結(jié)論：USP3的168位半胱氨酸和56位組氨酸對(duì)于其去泛素化活性都是必不可少的。

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7.USP3與泛素化的RIG-I特異性結(jié)合并切割多泛素鏈??? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)，表達(dá)兩種USP3突變體的細(xì)胞中RIG-I(N)的K63-泛素化要比表達(dá)WT USP3的細(xì)胞強(qiáng)得多。另外，RIG-I（N）與USP3（C168S）或USP3（H56A）的相互作用也比WT USP3的相互作用強(qiáng)得多。相關(guān)性表明，USP3可能僅與泛素化的RIG-I相互作用。

????????作者發(fā)現(xiàn)RIG-1（N）的K172R或D122A突變體均不能激活下游I型IFN信號(hào)。研究表明，USP3無(wú)法與泛素化程度較弱的RIGI（K172R）相互作用。相比之下，USP3與強(qiáng)泛素化的RIG-1（D122A）突變體有較強(qiáng)的相互作用，盡管它未能激活MAVS和I型IFN信號(hào)。

研究結(jié)論：USP3特異性結(jié)合泛素化的RIG-I和MDA5蛋白并切割其上結(jié)合的多泛素鏈，切割完成后USP3會(huì)從這些蛋白上脫離。

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結(jié)論與討論

????????研究表明USP3通過(guò)靶向RIG-I抑制I型IFN信號(hào)通路的激活。下調(diào)USP3可以特異性增強(qiáng)RIG-l上的K63-泛素化,上調(diào)IRF3的磷酸化，并促進(jìn)I型IFN細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抗病毒免疫。作者進(jìn)一步證明，病毒感染或配體刺激下USP3與RLRs結(jié)合并切割多泛素鏈。作者的發(fā)現(xiàn)確定了USP3在RIG-I激活中的作用，并闡明了USP3抑制RIG-l信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗病毒免疫的相關(guān)機(jī)制。

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Thank you!

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原文鏈接:https://www.nature.com/articles/cr2013170