干貨 | 鏈特異性RNA-seq文庫構建有哪些方法？
相比于普通的RNA-seq文庫，鏈特異性RNA-seq保留了轉(zhuǎn)錄本的方向信息，可以確定reads是來源于正鏈或負鏈，使得基因定量和可變剪切事件檢測更準確，對挖掘天然反義LncRNA的信息，分析基因結(jié)構及功能分析更有利。
那么有哪些方法可以實現(xiàn)鏈特異性文庫構建？這些不同的方法分別適合哪類RNA樣本建庫呢？今天，小編將給大家進行詳細解答
如何構建鏈特異性文庫
目前鏈特異性文庫的建庫方法有很多種，主要分為2類。第一類是在RNA的3’和5’端加上不同的接頭，2個不同的接頭序列標記RNA的3’和5’端（圖1A）。第二類依賴于化學修飾標記一條鏈，使得堿基發(fā)生變化或鏈被降解（圖1B）。
不同RNA樣本如何構建鏈特異性文庫
01
小RNA屬于非編碼核糖核酸（ncRNA），在基因調(diào)控中有重要的作用，包括miRNA/piRNA/tRF&tiRNA/tRNA/snRNA/snoRNA等。由于小RNA片段比較小，比如miRNA（17-25 nt），piRNA （24-35 nt），tRNA （60-95 nt），不適合使用隨機引物合成cDNA（片段越小，隨機引物可結(jié)合的位點越少）。
同時小RNA也不帶有Poly （A）尾巴，無法使用Oligo dT引物合成cDNA。因此，Small RNA樣本通常采用RNA ligation的方法在RNA的3’和5’端分別連接接頭來構建鏈特異性文庫。
02
對于mRNA/LncRNA/CircRNA等通常大于200 nt，可以使用隨機或Oligo dT引物合成cDNA第一鏈。在合成cDNA第二條鏈的時候加入dUTP，dUTP的鏈可以被酶消化或擴增的時候用不識別dUTP的聚合酶。
03
對于一些難擴培的細胞或者從組織上直接分離下的少量細胞，如特殊的組織，血清/血漿以及外泌體等樣本，能夠獲取的RNA總量可能在10 ng以下。
對于微量RNA鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫構建，通常使用SMART技術，通過隨機或oligo dT引物（帶一段接頭序列），合成cDNA第一鏈，并在3'端加上三個C，進一步使用TSO ( template-switching oligo )引物通過鏈置換添加另一端接頭序列，保留了RNA的鏈來源信息。
各種鏈特異性文庫測序結(jié)果對比
研究者使用釀酒酵母轉(zhuǎn)錄組作為基準，比較了多種文庫構建方法，發(fā)現(xiàn)在鏈特異性、文庫復雜性、均一性和覆蓋連續(xù)性、與已知注釋一致性，及表達譜的準確性方面都存在顯著差異。
通過權衡每種方法的性能和簡易性，研究者認為dUTP二鏈標記方法最好，在單端和雙端測序數(shù)據(jù)中Unique比例，5’和3‘端的轉(zhuǎn)錄本分布比例以及樣本間重復性方面均比其它方法表現(xiàn)優(yōu)異。
ABclonal 的RNA-seq鏈特異性文庫構建試劑盒也是采用dUTP二鏈標記方法，確定轉(zhuǎn)錄本來源于正義鏈或反義鏈，更準確定量基因表達和可變剪切事件，提高反義轉(zhuǎn)錄本檢出率和無參組裝效率，獲得最真實的樣本轉(zhuǎn)錄信息。
ABclonal
公司簡介
愛博泰克生物科技有限公司（ABclonal Technology Co.,Ltd.）成立于2011年，作為生命科學解決方案的提供商，旨在為更多的科研工作者、IVD企業(yè)、新技術開發(fā)企業(yè)提供抗體、酶、NGS產(chǎn)品和蛋白制品等全套解決方案。
