引言

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用在細(xì)胞決策中無處不在，控制它們?cè)诤铣缮飳W(xué)中將變得越來越重要。雖然蛋白質(zhì)相互作用是天然生物電路的核心，但創(chuàng)建新邏輯電路的工作主要集中在 DNA、轉(zhuǎn)錄或 RNA層面的控制。最近，通過重新連接原生信號(hào)通路、用盤繞線圈將蛋白質(zhì)連接在一起或創(chuàng)建蛋白酶級(jí)聯(lián)，產(chǎn)生了基于蛋白質(zhì)的電路；然而，這些電路都是由有限的構(gòu)件庫構(gòu)建的，這阻礙了它們的可擴(kuò)展性。從頭開始設(shè)計(jì)基于蛋白質(zhì)的邏輯門，調(diào)節(jié)任意的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，可以為細(xì)胞內(nèi)外新的基于蛋白質(zhì)的控制系統(tǒng)打開大門。

邏輯門設(shè)計(jì)原則

原則上說，利用一組異源二聚體分子從頭設(shè)計(jì)各種邏輯門是可能的。例如，給定假想的異源二聚體對(duì) A:A′、B:B′ 和 C:C′，通過基因融合 A′和 B，以及 B′和 C，就能構(gòu)建出調(diào)節(jié) A 與 C′關(guān)聯(lián)的 AND 門：只有在 A′-B和B′-C同時(shí)存在的情況下才會(huì)發(fā)生關(guān)聯(lián)（此處及下文中的"："表示非共價(jià)相互作用，"-"表示通過柔性連接體進(jìn)行的基因融合）。在構(gòu)建這種關(guān)聯(lián)邏輯門時(shí)，需要具備幾個(gè)構(gòu)件特性。

• 首先，應(yīng)該有許多相互正交的異二聚體對(duì)，這樣邏輯門的復(fù)雜性就不會(huì)受到單個(gè)元素?cái)?shù)量的限制。

• 其次，構(gòu)件應(yīng)具有模塊化和相似的結(jié)構(gòu)，這樣在構(gòu)建邏輯門時(shí)就不必考慮構(gòu)件形狀和其他特性的差異。

• 第三，單個(gè)構(gòu)件應(yīng)能以不同的可調(diào)親和力與多個(gè)伙伴結(jié)合，從而通過破壞已有的低親和力相互作用來執(zhí)行否定操作。

• 第四，相互作用應(yīng)該是合作性的，從而使門的激活對(duì)輸入中的化學(xué)計(jì)量失衡不敏感。例如，在上述 AND 門中，如果相互作用不合作，那么大量過剩的 A′-B 將使平衡趨向于部分組裝的復(fù)合物（A′-B 與 A 或 B′-C，但不是兩者），這將限制門的激活。

圖表說明概述了設(shè)計(jì)基于蛋白質(zhì)的協(xié)同邏輯門研究的主要方面：(A) A:A'異源二聚體結(jié)構(gòu)單元的骨架結(jié)構(gòu)及其氫鍵網(wǎng)絡(luò)示意圖。(B) 介紹描述誘導(dǎo)二聚系統(tǒng)的熱力學(xué)循環(huán)。(C) 模擬展示了誘導(dǎo)二聚系統(tǒng)在熱力學(xué)平衡下的行為。在最終形成的三聚復(fù)合物中，合作性的影響非常明顯，當(dāng)二聚體蛋白過量時(shí)，三聚復(fù)合物的形成就會(huì)減少。(D) 通過圓二色性（CD）監(jiān)測(cè) 6 氨基酸和 12 氨基酸連接體設(shè)計(jì)的平衡變性實(shí)驗(yàn)。(E）帶有 6 個(gè)氨基酸連接體的 1'-2' 的小角 X 射線散射（SAXS）實(shí)驗(yàn)曲線，與 1:1' 異源二聚體的計(jì)算曲線相匹配。(F）帶有六位殘基連接體的誘導(dǎo)二聚系統(tǒng)示意圖，以及隨后面板中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(G）在 1 存在和不存在的情況下，2 對(duì) 1'-2' 的本征質(zhì)譜滴定。(H) 1'-2' 與 1 和 2 的 nMS 滴定。(I) 在酵母中測(cè)試誘導(dǎo)二聚化系統(tǒng)的示意圖及體內(nèi)結(jié)果。(K）兩輸入 AND 門示意圖及 nMS 滴定結(jié)果。(M）三輸入 AND 門示意圖，以及 nMS 滴定結(jié)果。

作者探索了利用全新設(shè)計(jì)的具有氫鍵網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的特異性的異二聚體來設(shè)計(jì)滿足上述所有四項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的邏輯門的可能性。具有氫鍵網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)特異性的相互正交設(shè)計(jì)異源二聚體（DHD，以下用數(shù)字表示，如 1 和 1′ 構(gòu)成一對(duì)同源物；表 S1）（如圖 1A）可用于構(gòu)建邏輯門，滿足條件 1（正交性）。異源二聚體界面都具有相同的四螺旋束拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖 1A），滿足條件 2（模塊化）。共享的相互作用界面允許配對(duì)之間進(jìn)行有限的交叉對(duì)話，從而形成了結(jié)合親和力的層次結(jié)構(gòu)，滿足了條件 3（多種結(jié)合特異性）。受自然界合作系統(tǒng)的啟發(fā)，作者試圖通過構(gòu)建單體融合體（上例中的 A′-B 和 B′-C）來實(shí)現(xiàn)條件 4（合作性），即在融合體內(nèi)埋藏（與 A 和 C′的）相互作用界面。暴露這些埋藏界面所需的自由能將阻礙柵極活化，因此作者推斷，可以對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，使兩個(gè)伙伴的結(jié)合能之和足以克服這一障礙，而不是任何一個(gè)伙伴單獨(dú)的結(jié)合能之和，從而確保合作柵極活化。如果條件 2（模塊化）成立，那么確保合作性的單一方案原則上可以適用于多種柵極配置。

如果結(jié)合是非合作的，當(dāng) A′-B過量時(shí)，三聚體復(fù)合物的形成就會(huì)減少。相反，如果是合作結(jié)合，則三聚體復(fù)合物的形成對(duì)二聚體過量不那么敏感。假設(shè)二聚體（A′-B）的折疊四螺旋束狀狀態(tài)由于埋藏的疏水相互作用表面而反對(duì)與 A 或 B′結(jié)合。隨后，作者測(cè)試了連接 A′和 B 的不同長(zhǎng)度的柔性連接體。這些構(gòu)建體保持穩(wěn)定。原位質(zhì)譜法（nMS）用于研究體外的合作性，結(jié)果表明，加入 1 后，2 與 1′-2′ 之間的結(jié)合顯著增加。此外，即使在 1′-2′ 過量 6 倍的情況下，結(jié)合仍然很牢固。利用基于酵母的檢測(cè)方法，活細(xì)胞中的合作性也得到了證實(shí)。

更復(fù)雜的邏輯門設(shè)計(jì)

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索了更復(fù)雜的邏輯門，如雙輸入 AND 門和三輸入 AND 門，結(jié)果表明即使在這些更復(fù)雜的配置中，合作結(jié)合仍然有效。

研究隨后擴(kuò)展到設(shè)計(jì)一系列雙輸入合作誘導(dǎo)蛋白異二聚體（CIPHR）邏輯門。這些邏輯門涉及設(shè)計(jì)的異源二聚體蛋白（DHD）的模塊化組合及其與效應(yīng)蛋白的融合，以根據(jù)輸入控制共聚或解離。這項(xiàng)研究證明了在體外和活細(xì)胞中利用全新設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)相互作用設(shè)計(jì)和實(shí)施基于合作蛋白質(zhì)的邏輯門的可行性，并探索了基于這些原理構(gòu)建更復(fù)雜邏輯門的方法。

圖中展示了基于合作蛋白的雙輸入邏輯門（CIPHR 門）的構(gòu)造和功能：(A) CIPHR 邏輯門由設(shè)計(jì)的異源二聚體蛋白質(zhì)（DHD）構(gòu)建而成，輸入為單體或共價(jià)連接的單體。門利用設(shè)計(jì)的同源相互作用或觀察到的結(jié)合親和力層次。(B）利用正交 DHD 相互作用構(gòu)建的雙輸入 AND 門。(C) 基于正交 DHD 相互作用的雙輸入 OR 門。(D) 利用多特異性和競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)建的 NOT 門。(E) 基于多特異性和競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合的 NOR 門。(F) 利用多特異性和競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)建的 XNOR 門。(G) 基于多特異性和競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合的 NAND 邏輯門。

對(duì)于每個(gè)邏輯門，黑點(diǎn)代表經(jīng)背景生長(zhǎng)校正的單個(gè)酵母雙雜交（Y2H）生長(zhǎng)測(cè)量值，其平均值用綠條表示?；疑娇虮硎臼褂玫?DHD 對(duì)，藍(lán)色方框表示親和力梯度。輸入狀態(tài)和預(yù)期輸出分別用中間和右邊圖塊中的 "0 "和 "1 "表示。圖中展示了這些基于合作蛋白的邏輯門在各種邏輯運(yùn)算中的通用性和功能性。

本圖展示了基于蛋白質(zhì)的三輸入合作邏輯門（CIPHR 門）：(A) 一個(gè)三輸入 AND 邏輯門的示意圖，其中單體 1 和 2 通過輸入 1′-4′、4-3′ 和 3-2′ 結(jié)合在一起。(B) nMS 結(jié)果證實(shí)，只有在所有三個(gè)輸入都存在的情況下，三輸入 AND 門才能被正確激活。(C) 三輸入 OR 門的示意圖，其中任何一個(gè)輸入（11-1、11-6′或 11-7′）都通過 1′、6 或 7 將 AD 連接到 DBD。(D）酵母-兩系雜交（Y2H）結(jié)果表明，任何一個(gè)輸入端都能激活三輸入 OR 門。(E) 分立正則表達(dá)式（DNF）門的示意圖。(F) 證明 DNF 邏輯門正確激活的 Y2H 結(jié)果。每個(gè)門的單個(gè)測(cè)量值以黑點(diǎn)表示，平均值以綠條表示?；疑娇虮硎鹃T中使用的 DHD 對(duì)。

圖中展示了基于設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)相互作用成功構(gòu)建和運(yùn)行的三輸入?CIPHR 邏輯門。研究利用設(shè)計(jì)的異源二聚體蛋白（DHD）構(gòu)建了各種基于合作蛋白的兩輸入和三輸入邏輯門（CIPHR 門），并評(píng)估了它們的功能：

• 通過將特定輸入分別與 Gal4 激活結(jié)構(gòu)域（AD）和 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）融合，創(chuàng)建了 AND 和 OR 邏輯門，只有當(dāng)兩個(gè)輸入同時(shí)存在時(shí)，邏輯門才會(huì)生長(zhǎng)。

• 其他邏輯門（NOT、NOR、XNOR 和 NAND）是根據(jù)觀察到的 DHDs 結(jié)合親和力層次，利用多特異性和競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合原理構(gòu)建的。

• 利用原生質(zhì)譜（nMS）和酵母-雙雜交（Y2H）試驗(yàn)對(duì)三輸入門（AND、OR 和 CIPHR-雙結(jié)正則表達(dá)式）進(jìn)行了表征，證實(shí)了它們的設(shè)計(jì)行為。

• 利用 NanoBiT 分裂熒光素酶系統(tǒng)根據(jù)輸入狀態(tài)控制熒光素酶的活性，證明了 CIPHR 邏輯門可用于重組分裂酶的活性。

• 研究人員探索了 CIPHR 與 TALE-KRAB 系統(tǒng)的結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)可編程治療應(yīng)用，從而控制 T 細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)。

CIPHR 門的系統(tǒng)化設(shè)計(jì)利用了從頭開始的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)，創(chuàng)造出了多功能的功能邏輯電路，可以與各種蛋白質(zhì)致動(dòng)域連接，在不同的環(huán)境中提供了潛在的應(yīng)用。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了從頭蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)與 nMS 等實(shí)驗(yàn)技術(shù)之間的協(xié)同作用，并展示了從頭蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)接近天然蛋白質(zhì)組裝復(fù)雜性的能力。CIPHR 門為多功能信號(hào)處理和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用控制提供了一個(gè)平臺(tái)，對(duì)包括合成生物學(xué)和治療應(yīng)用在內(nèi)的各個(gè)領(lǐng)域都有潛在影響。參考資料：

Chen Z, Kibler R D, Hunt A, et al. De novo design of protein logic gates[J]. Science, 2020, 368(6486): 78-84.

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