腸道AAV研究簡(jiǎn)介

腸道是人體重要的消化器官和排毒器官，同時(shí)也是重要的免疫器官，有將近70%以上的免疫細(xì)胞分布在腸黏膜上，承擔(dān)著人體70%以上的免疫功能。腸道相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的破解和治療所面臨的挑戰(zhàn)，使得研究腸道基因靶向技術(shù)研究迫在眉睫。雖然目前已有大量利用病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的臨床前數(shù)據(jù)，但在腸道中的研究仍然較少。對(duì)于腸道的早期研究主要集中在粘膜轉(zhuǎn)導(dǎo)上，但由于腸道管腔條件惡劣及腸細(xì)胞代謝周轉(zhuǎn)率較高導(dǎo)致其成功率較低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）因其血清型種類(lèi)多、表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)以及低免疫性的特點(diǎn)使腸道基因轉(zhuǎn)移的效率得到提高，但是如何提高AAV在腸道中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和特異性細(xì)胞靶向仍是腸道基因治療需要克服的障礙。

腸道AAV血清型和啟動(dòng)子的選擇

AAV2、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10對(duì)腸道組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，其中AAV7對(duì)小腸的感染效率相對(duì)較高，AAVrh10已被證明能夠在腸道中長(zhǎng)效表達(dá)外源基因，尤其是在結(jié)腸中。目前研究中應(yīng)用較多的血清型是AAV9，啟動(dòng)子通常選擇廣譜型啟動(dòng)子CMV。

小腸（SI）結(jié)腸（Colon）中AAV血清型趨向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比較

（Steven P., Annette M., Stacy P., et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012.）

AAV在腸道中注射方式

腸組織常見(jiàn)的注射方式有尾靜脈注射、腹腔注射、口服、灌腸和腸系膜上動(dòng)脈（SMA）注射等。其中尾靜脈注射和腹腔注射作為系統(tǒng)性給藥方式，雖然操作簡(jiǎn)單，損傷性小，但是注射量較大，特異性不強(qiáng)。口服和灌腸，都屬于腔內(nèi)給藥，主要是黏膜的轉(zhuǎn)導(dǎo)，但由于胃酸及腸蛋白水解酶等的中和作用，因此這兩種方式的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并不高。在這幾種注射方式中，SMA注射效果較好，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作手法要求較高，對(duì)小鼠傷害性也較大。腔內(nèi)給藥和系統(tǒng)性注射的操作相對(duì)簡(jiǎn)單，此處不進(jìn)行贅述，下面分享SMA注射的操作步驟供參考：

腸道AAV SMA注射步驟

1.將小鼠以右側(cè)臥位固定在手術(shù)板上，保持四肢松弛，放入含2-4.5% O2的異氟醚誘導(dǎo)室進(jìn)行麻醉。小鼠深度麻醉后，將其放在手術(shù)臺(tái)上，對(duì)小鼠手術(shù)區(qū)域做去毛及消毒處理。

2.手術(shù)開(kāi)始前，皮下注射丁丙諾啡進(jìn)行手術(shù)鎮(zhèn)痛；沿左腋線最后一個(gè)肋間隙和肋下區(qū)域注射布比卡因進(jìn)行局部鎮(zhèn)痛。

3.沿著腋線和側(cè)腹，在脾臟區(qū)域的左側(cè)皮膚上開(kāi)一個(gè)1-2 cm的切口，切開(kāi)腹外斜肌，使用微型牽引器將皮膚和腹壁固定，并用溫鹽水紗布覆蓋小腸防止縮回，暴露SMA。

4.在放大20倍的情況下，將SMA輕輕地從腹膜后剝離，在SMA的近端接頭周?chē)胖靡粋€(gè)小的穩(wěn)定接頭連接注射針，使用微血管夾暫時(shí)切斷腹主動(dòng)脈的血液供應(yīng)。

5.將定制33號(hào)1/2”針頭連接到250μL漢密爾頓TLL氣密性進(jìn)樣針注射器上，輕輕插入SMA進(jìn)行病毒注射。將固定帶輕扎血管，防止注射部位泄漏。

6.注射后立即取下針頭，縫合注射部位。取下固定帶和微血管夾，使血液回流至小腸。使用無(wú)菌棉簽輕輕按壓注射部位進(jìn)行止血。

7.在腹腔內(nèi)注射1mL無(wú)菌溫鹽水后，對(duì)小鼠進(jìn)行縫合。

8.術(shù)后每15min對(duì)小鼠進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)，直到小鼠能夠腹臥。每2小時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)，直至放回籠中。