上期我們介紹了自噬干貨分享系列之內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的研究策略，那么本期將繼續(xù)進行“自噬干貨分享”，本期內(nèi)容小編將主要從線粒體自噬分類、介導(dǎo)線粒體自噬的經(jīng)典通路、線粒體自噬的誘導(dǎo)與抑制來進行介紹。

什么是線粒體自噬？

在ROS、營養(yǎng)缺乏、細胞衰老等外界刺激的作用下，細胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化出現(xiàn)損傷，損傷的線粒體被特異性包裹進自噬體中并與溶酶體融合，從而完成溶酶體的降解，這個過程稱為線粒體自噬。線粒體自噬是細胞在應(yīng)對氧化應(yīng)激等壓力條件下的生物學(xué)現(xiàn)象，用于清除多余的或者功能失調(diào)的線粒體，以維持線粒體數(shù)目和質(zhì)量的平衡，對于整個線粒體網(wǎng)絡(luò)的功能完整性和細胞生存來說十分關(guān)鍵。

線粒體自噬分類

1. 基礎(chǔ)線粒體自噬：細胞持續(xù)清理衰老和損傷的線粒體，確保線粒體能循環(huán)利用。線粒體自噬水平較高的器官包括：心臟、肝臟、腎臟、骨骼肌和神經(jīng)系統(tǒng)等；

2. 應(yīng)激誘導(dǎo)型線粒體自噬：細胞外應(yīng)激信號會影響線粒體的生理功能，并且會引起線粒體膜電位消耗，導(dǎo)致急性線粒體清除；

3. 程序性線粒體自噬：程序性線粒體自噬會在不同細胞的發(fā)育過程中被激活，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育，體細胞向多能干細胞的化學(xué)重編程過程，心肌細胞的成熟，紅細胞分化，受精后精子來源的線粒體清除等過程。

圖1.線粒體自噬的分類[1]

介導(dǎo)線粒體自噬的經(jīng)典通路

1、PINK1/Parkin信號通路。

在健康的線粒體中，PTEN誘導(dǎo)激酶1（PINK1）通過線粒體靶向序列靶向線粒體，并通過TOM/TIM復(fù)合體進入到線粒體內(nèi)膜，隨后PINK1被線粒體內(nèi)膜中的蛋白酶PARL切割，并最終被蛋白酶體降解。

當(dāng)線粒體受損時，線粒體膜電位下降，PINK1無法進入線粒體內(nèi)膜并在線粒體外膜積累，激活并招募Parkin，Parkin介導(dǎo)線粒體底物泛素化，泛素化后，包括p62在內(nèi)的受體蛋白在線粒體外膜積累，導(dǎo)致泛素化產(chǎn)物通過與LC3結(jié)合被招募到自噬體中，成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，包含的線粒體隨后被降解。

圖2.PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬[1]

2、 BNIP3/NIX信號通路。

BNIP3和NIX均位于線粒體的外膜，在缺血、缺氧的條件下，BNIP3 可通過以下2 種途徑誘導(dǎo)細胞內(nèi)線粒體自噬的發(fā)生：

①BNIP3能通過其BH3結(jié)構(gòu)域調(diào)控自噬的核心蛋白Beclin-1競爭性地與Bcl-2結(jié)合，進而誘導(dǎo)Beclin-1的大量釋放，激活線粒體自噬的發(fā)生；

②BNIP3的N端具有LIR序列，其可識別LC3，并與之直接結(jié)合，從而誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。

圖3.受體介導(dǎo)的自噬[1]

3、 FUNDC1信號通路。

FUNDC1是調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵受體。

在正常條件下，F(xiàn)UNDC1被酪氨酸激酶磷酸化，此時與LC3的親和力降低在缺血缺氧條件下酪氨酸激酶被滅活，F(xiàn)UNDC1與LC3的親和力顯著提升，并且FUNDC1可以被絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶通過去磷酸化的形式激活，進而誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。

線粒體自噬的誘導(dǎo)與抑制

線粒體自噬與藥物誘導(dǎo)的組織損傷神經(jīng)退行性疾病癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)因此有關(guān)線粒體自噬的問題越來越受到學(xué)者們的關(guān)注，在線粒體自噬的研究中，一般通過人為干預(yù)的方式來誘導(dǎo)或抑制線粒體自噬，方法主要包括藥物處理、物理損傷、饑餓、線粒體自噬基因的敲降或過表達等

常用的線粒體的解偶聯(lián)劑CCCP和FCCP作為誘導(dǎo)劑，引發(fā)線粒體短時間內(nèi)劇烈的去極化和線粒體自噬的發(fā)生，但造成細胞骨架的破壞及溶酶體酸化的抑制，因此，實驗中如抗霉素A等比較溫和的誘導(dǎo)藥物。此外，饑餓和光照輻射也可以誘導(dǎo)部分線粒體發(fā)生自噬。

環(huán)孢菌素A是一種抑制線粒體通透性改變的藥物，作為線粒體自噬誘導(dǎo)后的保護劑，可明顯降低線粒體自噬體的總量，此外，非免疫抑制劑NIM811也可發(fā)揮同樣作用。

線粒體自噬相關(guān)基因的敲低或過表達可用于某一特定基因在整個線粒體自噬通路中的功能研究，如在果蠅PINK1/Parkin依賴性線粒體自噬途徑的研究中發(fā)現(xiàn)，敲除PINK1和Parkin可造成線粒體自噬的抑制。

線粒體自噬研究工具

線粒體自噬受到了越來越廣泛的關(guān)注，那么我們?nèi)绾沃庇^地研究線粒體自噬呢？漢恒生物提供的線粒體自噬病毒研究工具，便于感染目的細胞后直觀地觀察線粒體自噬的變化。EGFP-LC3單標(biāo)記的熒光探針可以監(jiān)測 LC3 蛋白參與自噬起始過程，Mito-dsred線粒體特異性定位熒光探針可定位線粒體，兩者共轉(zhuǎn)染細胞即可準(zhǔn)確實時地追蹤線粒體自噬的動態(tài)過程。另外，mt-Keima探針可獨立應(yīng)用于線粒體自噬的研究，Keima是一種H敏感的熒光蛋白，發(fā)射峰為620nm，在中性和酸性環(huán)境中分別于440nm和550nm處被激發(fā)，因此，隨著時間的推移，遞送到溶酶體的keima量可以通過在550nm處激發(fā)的信號強度和在440nm處激發(fā)的信號強度的比值來估計。鑒于發(fā)生自噬的線粒體最終會進入酸性的溶酶體中，所以將特異性定位于線粒體（mitochondrial）基質(zhì)的靶向序列與keima融合形成mt-keima，可指示通過自噬途徑進入溶酶體中的線粒體。另外，我們還有Cox8a基因融合綠光和紅光（Cox8a-EGFP-mcherry）來研究線粒體自噬的病毒。

漢恒生物還有多種線粒體自噬通路單標(biāo)研究工具Parkin-EGFP、Bnip3-EGFP、Nix-EGFP、FUNDC1-EGFP，與Mito-dsred線粒體共感染目的細胞，confocal檢測共定位情況，可鑒別相關(guān)信號分子的線粒體轉(zhuǎn)位。

自噬研究工具相關(guān)產(chǎn)品列表：

? 本期“線粒體自噬研究”介紹就到此結(jié)束了，相信看到這里的小伙伴一定有所收獲，對于線粒體自噬也更加了然于心。下期我們將介紹“分子伴侶介導(dǎo)的自噬”，我們下期再見！

參考文獻：

[1] Palikaras, K., Lionaki, E. & Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nat Cell Biol 20, 1013–1022 (2018).

[2] 張迎梅，邱倩，漆永梅. 線粒體自噬的研究方法[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，49(5):7

[3] Yoshii, S.R. and N. Mizushima. Monitoring and Measuring Autophagy. Int J Mol Sci.2017; 18(9): 1865.

[4] Levine, B. and G. Kroemer. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 2008 Jan 11;132(1):27-42.

[5] Choi, A. M., S. W. Ryter and B. Levine. Autophagy in human health and disease. N Engl J.2013 Feb 14;368(7):651-62.