免疫印跡（Western blot, WB）是蛋白組學(xué)中檢測(cè)復(fù)雜生物提取物中特定蛋白質(zhì)存在的最常用方法之一。WB先要進(jìn)行 SDS-PAGE，然后將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用抗原 - 抗體 - 標(biāo)記物顯色來(lái)檢測(cè)樣品，可以用于定性和半定量。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提取

1. 細(xì)胞樣品在提取前需要使用PBS清洗兩遍，以減少培養(yǎng)基對(duì)樣品的干擾，懸浮細(xì)胞可500Xg低速離心后收集進(jìn)行蛋白提取。貼壁細(xì)胞可在培養(yǎng)器皿中直接進(jìn)行蛋白提取。蛋白提取前建議進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確定提取中添加裂解液的比例，得到最佳提取效率。

2. 組織樣品在提取前也需要用PBS清洗，一些含血量豐富的組織，建議使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，以避免血液中IgG對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。

3. 為了防止蛋白降解、去磷酸化，各種蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑都是必須的。

4. 在提取蛋白的時(shí)候僅僅靠裂解液有時(shí)候也不能達(dá)到完全抽提的效果，有條件的話，可以對(duì)抽提懸液進(jìn)行超聲破碎處理；超聲的時(shí)候，因?yàn)槌暟l(fā)熱損傷蛋白，需要把要超聲的樣本放到冰水混合物里。

5. 此外如果沒(méi)有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替來(lái)抽提蛋白，其效果類似于SDS裂解液，不過(guò)抽提后的樣本不能進(jìn)行濃度測(cè)定。

6. 蛋白煮沸變性一般是95-100°C，5-10min，水浴鍋煮沸時(shí)，可用帶夾EP管防止EP管蓋彈開(kāi)，使水浴鍋內(nèi)的水進(jìn)入而使樣品廢掉。

蛋白電泳

正確選擇凝膠濃度與電泳條件能夠讓目的蛋白區(qū)域最大限度的分離開(kāi)，從而使條帶的位置，雜帶位置等一些因素的影響降到最低；目的蛋白分子量與膠濃度的選擇見(jiàn)下表：

采用SDS-PAGE電泳，每孔上樣等體積總蛋白，上樣時(shí)，先加marker，如有空置的加樣孔，須加等體積的1×loading buffer，以防相鄰泳道樣品的擴(kuò)散。開(kāi)始電壓為80V，使樣品跑得慢一些，充分濃縮，到達(dá)分離膠后調(diào)為120V，電泳至溴酚藍(lán)要跑出即可終止電泳。關(guān)于電泳液，建議新鮮配制，也可先配10x的，然后現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。

Tips：蛋白電泳

玻璃板清洗后，為了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置幾分鐘，拿出來(lái)的時(shí)候后需平衡至室溫再灌膠，不然很容易產(chǎn)生氣泡

配膠用的試劑一般都是在4度冰箱保存，當(dāng)我們按比例配好混合液的時(shí)候，要等混合液恢復(fù)室溫時(shí)，再灌膠，不然也很容易產(chǎn)生氣泡

玻加水液封時(shí)，速度要慢，可用1ml*沿著膠板上沿反復(fù)移動(dòng)，不然很容易將分離膠沖變形

梳子注意和玻璃板匹配，1.5mm的梳子很難插進(jìn)1mm的玻璃板中，暴力插入會(huì)破壞膠板；如果1mm的梳子插到了1.5mm的玻璃板中，由于中間有空隙，就會(huì)有膠凝固在里面

濃縮膠凝好可以泡到電泳緩沖液里，比較容易拔出。

蛋白轉(zhuǎn)膜/膜的選擇

1.現(xiàn)在用的最多的是PVDF膜，用之前需注意：①先在純甲醇中浸濕膜15s，保證PVDF膜充分活化；②將膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡至少5min
2.C膜不需要甲醇活化。

膜的孔徑

1.根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的印跡膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固

2.通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的印跡膜。大于20KD的蛋白可用0.45μm 的膜，小于20KD的蛋白就要用0.2μm的膜

小分子蛋白

1.小分子蛋白很容易轉(zhuǎn)過(guò)，所以摸索適合自己蛋白的轉(zhuǎn)膜條件很重要，這一步很難說(shuō)一次就成功，所以剛開(kāi)始的時(shí)候可以在接觸膠面的PVDF膜上再放一張PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，立春紅染色，觀察使用的條件是否會(huì)轉(zhuǎn)過(guò)頭

2.小分子蛋白轉(zhuǎn)膜液中一定不要加SDS，因?yàn)镾DS會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效果

3.小分子蛋白濕轉(zhuǎn)參考100V恒壓，或者150-200恒流，40-60min，都可以跑出來(lái)結(jié)果，同時(shí)也可以保證內(nèi)參的效果很好

4.小分子蛋白轉(zhuǎn)膜液甲醇濃度為20%

5.分子量小于10 kDa的多肽或蛋白，建議使用Tricine-SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)。

大分子蛋白

1.轉(zhuǎn)膜時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)，220V，300mA，濕轉(zhuǎn)，建議時(shí)間在2h30min-3h，因?yàn)檗D(zhuǎn)膜時(shí)間很長(zhǎng)，可以預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液，同時(shí)提前準(zhǔn)備好足夠的冰袋降溫

2.轉(zhuǎn)膜液中可以加入適量SDS（濃度0.1%），對(duì)于大分子量蛋白加入SDS是為了增加了蛋白表面電荷，從而增加轉(zhuǎn)膜效率

3.大分子蛋白轉(zhuǎn)膜液甲醇濃度為5%

印跡膜封閉

1.脫脂奶是最常用的經(jīng)濟(jì)配方。

2.脫脂奶粉不能與生物素化的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼?；建議使用BSA。

3.分析磷酸化蛋白須用BSA。脫脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化;也不適用于堿性磷酸酶(AP)檢測(cè)系統(tǒng)。

4.如果用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)檢測(cè)系統(tǒng)，封閉液不應(yīng)加疊氮鈉(NaN3)，因?yàn)榀B氮鈉對(duì)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）有滅活作用。

5.如果用二抗抗體是堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)，可使用酪蛋白封閉，同時(shí)須選擇TBS緩沖溶液，不可使用PBS緩沖溶液，因?yàn)镻BS緩沖溶液干擾堿性磷酸酶。

一抗二抗孵育

1.建議孵育抗體之前一定要仔細(xì)看抗體說(shuō)明書(shū)，了解抗體的種屬來(lái)源和抗體的建議稀釋比例。

2.選擇二抗抗體取決于一抗抗體的動(dòng)物來(lái)源。例如,如果一抗抗體是小鼠來(lái)源單克隆抗體,二抗抗體必須是抗小鼠的抗體；如果一抗抗體是兔來(lái)源多克隆抗體,二抗抗體必須是抗兔的抗體。

3.建議使用商品化的抗體稀釋液稀釋一抗二抗，不僅能有效減少一抗或二抗的非特異性結(jié)合，并有效提升稀釋后抗體的穩(wěn)定保存時(shí)間，可重復(fù)利用。

顯影成像

1.建議使用高信號(hào)強(qiáng)度、高靈敏度、高穩(wěn)定性的ECL化學(xué)發(fā)光試劑。

2.顯影液務(wù)必覆蓋整個(gè)印跡膜。

3.顯影液A液和B液吸取過(guò)程中必須更換移液器*頭，避免相互污染失效。

4.ECL工作液需避免強(qiáng)氧化劑如次氯酸鈉等對(duì)工作液的影響。

5.須確保試劑瓶干凈，無(wú)微生物或其它試劑污染。為了小伙伴們的安全，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套。