如今，蛋白質(zhì)印跡廣泛用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中，以檢測(cè)生物樣品中感興趣的特定蛋白質(zhì)。該技術(shù)提供了有關(guān)目標(biāo)蛋白的信息，包括豐度和分子量，并提供了一種檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和翻譯后修飾的方法。

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Jackson公司Western印跡分六個(gè)階段進(jìn)行：

1.樣品制備

2.通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)

3.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移（電印跡）到膜上

4.膜阻塞

5.免疫檢測(cè)

6.可視化

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蛋白質(zhì)印跡可用于檢測(cè)天然和合成來(lái)源的蛋白質(zhì)。來(lái)自表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白和來(lái)自生物樣品的內(nèi)源蛋白都可以用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

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對(duì)于要通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析的蛋白質(zhì)，必須首先處理包含它們的樣品，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)可用于分析。例如，在篩選表達(dá)時(shí)，通過(guò)裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)以釋放蛋白質(zhì)，使其進(jìn)入分離基質(zhì)。

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蛋白質(zhì)提取之后可以進(jìn)行變性和還原以將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為其一級(jí)結(jié)構(gòu)，這使得它們可以在電泳期間通過(guò)它們的分子量進(jìn)行分離。

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SDS-PAGE使用?SDS?包裹蛋白質(zhì)，掩蓋其固有電荷并賦予與它們大小成正比的整體均勻電荷。

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然后將樣品加載到凝膠中，并施加電壓。蛋白質(zhì)向正J遷移。凝膠的密度阻礙了它們的遷移，使它們能夠按大小分開。分離后，通過(guò)將凝膠和膜直接接觸并施加電場(chǎng)將蛋白質(zhì)拉入基質(zhì)中，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移（電印跡）到膜上。

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蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移之后是封閉步驟，該步驟使用蛋白質(zhì)溶液來(lái)最大限度地減少非特異性相互作用。然后將膜與特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗一起孵育。

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在進(jìn)一步的封閉步驟之后，偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合，從而使靶蛋白可視化。

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比色或化學(xué)發(fā)光底物都可用于顯示來(lái)自報(bào)告酶偶聯(lián)物的信號(hào)。使用成像設(shè)備檢測(cè)來(lái)自熒光染料偶聯(lián)物的信號(hào)，并可用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)。

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蛋白質(zhì)印跡是一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室程序，可以檢測(cè)和分析許多蛋白質(zhì)及其相互作用。蛋白質(zhì)印跡的成功取決于抗體-抗原相互作用的特異性以及添加二抗的信號(hào)放大潛力。這些因素使蛋白質(zhì)印跡J其敏感，能夠檢測(cè)低至皮克水平的蛋白質(zhì)。根據(jù)試劑的種類和檢測(cè)方法的不同，可以獲得半定量和定量的結(jié)果。

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蛋白質(zhì)印跡可以高效可靠地進(jìn)行，以產(chǎn)生高質(zhì)量的印跡。本指南將幫助您選擇正確的試劑、選擇合適的抗體和檢測(cè)方法以及排除實(shí)驗(yàn)故障。

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Jackson公司樣品制備：

在電泳過(guò)程中準(zhǔn)確分離蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)印跡的關(guān)鍵步驟。它依賴于正確處理的樣品，以便感興趣的蛋白質(zhì)處于可以通過(guò)凝膠遷移的形式。

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可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)自各種來(lái)源的蛋白質(zhì)。樣品可能來(lái)自蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，例如哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，或來(lái)自臨床組織樣品，每種樣品都需要不同的處理來(lái)產(chǎn)生最終用途的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)提取方法詳見(jiàn)表（1）；然而，對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，通常不需要如此嚴(yán)格地處理樣品。

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由于免疫印跡的特異性，可以對(duì)用于蛋白質(zhì)印跡的樣品進(jìn)行粗略處理，以便提取蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到適合將樣品引入分離凝膠進(jìn)行電泳的溶液中。由于存在諸如?DNA?之類的聚合生物分子，粗樣品尤其可能是粘性的，并且可能會(huì)影響凝膠加載。

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Jackson公司細(xì)菌培養(yǎng)的示例樣品制備過(guò)程：

取?1 ml?大腸桿菌培養(yǎng)樣品并轉(zhuǎn)移到冰上的微量離心管中。

在?4°C?下以?13,000 rpm?轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)?20?分鐘。

棄去上清液。

在?50 μl?上樣緩沖液中重懸細(xì)胞，并在?100°C?下煮沸?5?分鐘。

13,000 rpm?離心?5?分鐘。

加載。

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Jackson公司貼壁細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物?(HEK293)?的示例樣品制備：

將組織培養(yǎng)板放在冰上，用冰冷的?PBS?清洗細(xì)胞。

吸出?PBS，然后加入適當(dāng)體積的裂解緩沖液（例如?1 mL?每?107?個(gè)細(xì)胞/100 mm?培養(yǎng)皿?150 cm2?燒瓶；0.5 mL?每?5×106?個(gè)細(xì)胞/60 mm?培養(yǎng)皿/75 cm2?燒瓶）。

使用細(xì)胞刮刀從孔/燒瓶中分離細(xì)胞，然后用移液器吸頭或通過(guò)胰蛋白酶消化攪拌。

將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的微量離心管中。

然后在?4°C?下對(duì)樣品進(jìn)行微量離心。條件取決于細(xì)胞類型，應(yīng)根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)設(shè)置確定。例如，HEK 293?可以在?1000 rpm?下耐受?15?分鐘。

從沉淀的細(xì)胞中吸出上清液并轉(zhuǎn)移到冰上的新鮮試管中。

將負(fù)載染料添加到上清液中并在?100°C?下煮沸?5?分鐘。

細(xì)胞沉淀也可能與上清液一起加載了染料。

將樣品以?13,000 rpm?的速度旋轉(zhuǎn)?5?分鐘，然后加載到凝膠中進(jìn)行電泳。

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Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)領(lǐng)域覆蓋各大學(xué)科研所和醫(yī)院里的動(dòng)物研究以及生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)的科學(xué)家。艾美捷科技是Jackson公司的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。