蛋白質(zhì)組學(xué)探究骨髓干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)能優(yōu)化神經(jīng)細(xì)胞微環(huán)境
●?前言
2021年11月歐易/鹿明生物合作客戶江蘇省南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室顧曉松院士團(tuán)隊(duì),顧蕓教授在Biomaterials期刊發(fā)表了題為“BMSC-derived extracellular matrix better optimizes the microenvironment to support nerve regeneration”的研究成果,通過(guò)TMT標(biāo)記蛋白組+免疫熒光研究方法,發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)能優(yōu)化神經(jīng)細(xì)胞再生微環(huán)境,為周圍神經(jīng)缺損臨床修復(fù)提供了新的替代方案。
中文標(biāo)題:骨髓干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)能更好地優(yōu)化支持神經(jīng)再生的微環(huán)境
研究對(duì)象:神經(jīng)細(xì)胞再生、細(xì)胞外基質(zhì)
發(fā)表期刊:Biomaterials
影響因子:12.479
發(fā)表時(shí)間:2021.11.13
合作單位:南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
運(yùn)用生物技術(shù):TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)(由歐易/鹿明生物提供技術(shù)支持)
●?研究背景
外傷性周圍神經(jīng)損傷是一種常見(jiàn)的臨床難題,目前的治療方法難度大、療效低。鑒于自體神經(jīng)移植供體病變的高風(fēng)險(xiǎn),以及供體組織的來(lái)源有限,創(chuàng)造一種有前途的組織工程神經(jīng)移植修復(fù)缺損神經(jīng)將是未來(lái)臨床治療神經(jīng)損傷的重要方向。
細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是一種復(fù)雜的、由可溶性和不可溶性分子組成的異質(zhì)網(wǎng)絡(luò),為細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)與修復(fù)提供了天然微環(huán)境的物理結(jié)構(gòu)和生化環(huán)境,越來(lái)越多的證據(jù)表明,ECM有助于指導(dǎo)細(xì)胞行為和組織再生?;谶@一認(rèn)識(shí),ECM神經(jīng)移植,如自然衍生的脫細(xì)胞組織(也稱為組織衍生的ECM支架),用單個(gè)ECM組件修飾的支架,以及培養(yǎng)的細(xì)胞衍生的ECM修飾的組織工程材料已經(jīng)被成功構(gòu)建。
●?研究思路
(點(diǎn)擊圖片查看大圖)
●?研究結(jié)果
1.TMT標(biāo)記蛋白組學(xué)分析細(xì)胞源的胞外基質(zhì)和脫細(xì)胞神經(jīng)的蛋白質(zhì)組
圖1 | 細(xì)胞來(lái)源的ecm和脫細(xì)胞神經(jīng)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究
a1:通過(guò)質(zhì)譜鑒定的2302個(gè)蛋白的Venn;
a2:PCA圖顯示15個(gè)樣本之間無(wú)監(jiān)督聚類;
a3:所有樣品蛋白質(zhì)的熱圖。顯著富集了下調(diào)(綠色)和上調(diào)(紅色)的細(xì)胞生物過(guò)程(p<0.05)。比例尺顯示表達(dá)水平(紅色表示上調(diào),綠色表示下調(diào));
b1:維恩圖比較不同組的137個(gè)基質(zhì)蛋白成分,直方圖顯示了特有或共有的蛋白數(shù)量。Uniq1分別表示SC-ECM、BMSC-ECM、SKP-SC-ECM或成纖維細(xì)胞- ecm中的特異性蛋白。Uniq2是指脫細(xì)胞神經(jīng)中的特定蛋白質(zhì)。Common指細(xì)胞衍生的ECM和脫細(xì)胞神經(jīng)共有的蛋白;
b2:5種ECM中基質(zhì)蛋白含量。
利用TMT標(biāo)記蛋白組學(xué)分析比較施萬(wàn)細(xì)胞(SCs)、成纖維細(xì)胞(FBs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、皮膚祖細(xì)胞分化的施萬(wàn)細(xì)胞(SKP-SCs)的ECM和脫細(xì)胞神經(jīng)的蛋白質(zhì)成分,發(fā)現(xiàn)五種細(xì)胞外基質(zhì)之間有76個(gè)共有蛋白質(zhì)(圖1A-a1)。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC-ECM)與一部分脫細(xì)胞神經(jīng)重疊,表明BMSC-ECM和脫細(xì)胞神經(jīng)之間有相似的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜(圖1A-a2)。研究者通過(guò)進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析和MatriSomeDB過(guò)濾來(lái)比較和分析五種細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)蛋白類型和含量的差異,發(fā)現(xiàn)BMSC-ECM與脫細(xì)胞神經(jīng)最為相似,因此最終確定BMSC可以作為細(xì)胞外基質(zhì)生成的優(yōu)良親本細(xì)胞。
2.細(xì)胞源性細(xì)胞外基質(zhì)和脫細(xì)胞神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和特征
免疫染色、共聚焦成像及3D結(jié)構(gòu)重建分析并構(gòu)建了來(lái)自SCs、FB、BMSCs、SKP-SCs和脫細(xì)胞神經(jīng)的ECM的3D空間結(jié)構(gòu)(圖2)。此外,利用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)分析揭示細(xì)胞衍生的ECM和脫細(xì)胞神經(jīng)的微結(jié)構(gòu)(納米纖維的結(jié)構(gòu))。
結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和細(xì)胞來(lái)源的ECM和脫細(xì)胞神經(jīng)的結(jié)構(gòu)特征,研究人員認(rèn)為BMSC-ECM可能更接近于模仿天然神經(jīng)ECM的組織特異性生化和結(jié)構(gòu)屬性。
圖2 |?免疫染色3D、掃描電鏡圖和投射電鏡圖?
A. ECMs結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)ecm的纖維連接蛋白(白色)、層粘連蛋白(紅色)、I型膠原蛋白(金色)、IV型膠原蛋白(綠色)免疫染色3D圖像,用Imaris軟件分析,比例尺5μm。
B.掃描電鏡圖(b1)和透射電鏡圖(b2)顯示細(xì)胞來(lái)源的ecm和脫細(xì)胞神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)。比例尺,(b1)為5μm, (b2)為1μmb2
3.背根神經(jīng)節(jié)(DRG)體外培養(yǎng)模型評(píng)估物種ECMs支持神經(jīng)突生長(zhǎng)的能力
DRGs分別在來(lái)源于施萬(wàn)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和皮膚祖細(xì)胞分化的施萬(wàn)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng),以聚賴氨酸包被的載玻片上培養(yǎng)為對(duì)照。48小時(shí)后, NF200免疫熒光染色測(cè)定DRG神經(jīng)元的生長(zhǎng),并用層粘連蛋白標(biāo)記細(xì)胞外基質(zhì)。在ECM上培養(yǎng)的從DRGs延伸的神經(jīng)突起比在涂有PLL的載玻片上培養(yǎng)的從DRGs延伸的神經(jīng)突起更長(zhǎng)且更分叉,表明ECM顯著增強(qiáng)了DRGs的軸突生長(zhǎng)(圖3a和圖3b)。
此外,在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)的DRG神經(jīng)突起的突起長(zhǎng)度和覆蓋面積大于在其他細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)的(圖3c)。這一結(jié)果進(jìn)一步證明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能是生成更適于神經(jīng)再生微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)親代細(xì)胞。
圖3 | ECM上DRG神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)
A. 雙免疫熒光顯微圖顯示DRGs的軸突生長(zhǎng)(NF-200,綠色),培養(yǎng)于SC、BMSC、SKP-SC和成纖維細(xì)胞衍生的ECM(層粘連蛋白,紅色)上,對(duì)照為PLL,比例尺為500μm;
B. 使用相對(duì)定量方法測(cè)量NF陽(yáng)性神經(jīng)突起延伸的最大距離和分支數(shù)量。比例尺1000μm;
C. 從染色觀察得到的直方圖,顯示從DRGs延伸的軸突長(zhǎng)度和面積的定量比較(n = 5)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001與pll涂層;# # # p < 0.01, p < 0.05, # # # p < 0.001和SC-ECM;Δp < 0.05,ΔΔp < 0.01,ΔΔΔp < 0.001和BMSC-ECM。
4.神經(jīng)移植物制備
為了證明細(xì)胞外基質(zhì)支持體內(nèi)神經(jīng)再生,開(kāi)發(fā)了基于殼聚糖/絲素蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物,如示意圖所示(圖4a)。基于蛋白質(zhì)定量,將施萬(wàn)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和皮膚祖細(xì)胞分化的施萬(wàn)細(xì)胞按比例培養(yǎng)在殼聚糖導(dǎo)管/絲素蛋白基神經(jīng)支架上,并用維生素C刺激14天。接下來(lái),用掃描電鏡研究去細(xì)胞前后細(xì)胞在絲素蛋白纖維和殼聚糖導(dǎo)管上的粘附和生長(zhǎng)。我們注意到細(xì)胞螺旋纏繞,包裹SF纖維形成并排或端對(duì)端的多層細(xì)胞鏈;然而,它們的生長(zhǎng)在殼聚糖導(dǎo)管的外表面和內(nèi)壁上顯示出不規(guī)則的排列。脫細(xì)胞后,細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)學(xué)特征顯示了包裹SF纖維的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),或者在殼聚糖導(dǎo)管的外壁和內(nèi)壁上的松散組織的紗布網(wǎng)(圖4b)。
圖4? | ECM-NGs的制備以及特性
5.細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物的體內(nèi)植入及其評(píng)價(jià)
5.1神經(jīng)功能評(píng)估
為了研究細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的能力,將細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物和對(duì)照支架植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損(10 mm)中。從術(shù)后4周開(kāi)始,進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,觀察各組大鼠和對(duì)照組大鼠感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況(圖5A a1)。BMSC-ECM-NG組的足跡、接觸強(qiáng)度和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)比其他組恢復(fù)更好(圖5a2-4)。經(jīng)過(guò)感覺(jué)功能測(cè)試發(fā)現(xiàn)BMSC-ECM-NG組表現(xiàn)出比其他組更好的機(jī)械異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏的恢復(fù),其水平接近基線(正常),在NG移植后12周沒(méi)有顯著差異(p = 0.81 )(圖5a5-6)。
圖5 |? ECM-NG移植后神經(jīng)功能的評(píng)價(jià)
5.2移植后軸突再生觀測(cè)結(jié)果展示
為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物在神經(jīng)再生中的作用,用NF200和S100β進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)再生。結(jié)果顯示,兩組再生軸突均隨殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)SF填充物從近端殘端向遠(yuǎn)端殘端延伸,術(shù)后2周BMSC-ECM-NG組和SC-ECM-NG組的神經(jīng)纖維長(zhǎng)度明顯大于其他三組(圖6a)。
圖6 | 細(xì)胞外基質(zhì)-神經(jīng)生長(zhǎng)因子移植后軸突再生
5.3移植后軸突髓鞘再生觀測(cè)結(jié)果展示
再生神經(jīng)的透射電鏡檢查顯示,髓鞘再形成的神經(jīng)纖維呈簇狀分散,結(jié)構(gòu)致密均勻,由清晰的電子致密髓鞘組成。此外,BMSC-ECM和SC-ECM修飾的神經(jīng)移植物2組的再生神經(jīng)的髓鞘厚度、髓鞘層數(shù)和平均軸突直徑均高于其他細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物組?(圖7)。
圖7 | 細(xì)胞外基質(zhì)-神經(jīng)生長(zhǎng)因子移植后軸突髓鞘再生
5.4.靶肌肉的修復(fù)效果評(píng)估
坐骨神經(jīng)損傷通常會(huì)導(dǎo)致其目標(biāo)肌肉萎縮。靶肌肉的神經(jīng)再支配是衡量周圍神經(jīng)修復(fù)效果的重要指標(biāo)。用α-銀環(huán)蛇毒素和NF200免疫染色觀察和評(píng)估脛前肌的運(yùn)動(dòng)終板的形成。在所有組中,受傷側(cè)的運(yùn)動(dòng)終板與對(duì)側(cè)未受傷(正常)側(cè)的運(yùn)動(dòng)終板相比相對(duì)較小且不成熟。BMSC-ECM修飾的神經(jīng)移植物組中成熟的或重新神經(jīng)支配的終板比在其他細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物組中豐富得多。然而,SC-ECM修飾的神經(jīng)移植物和BMSC-ECM修飾的神經(jīng)移植物之間沒(méi)有觀察到可檢測(cè)的差異(p = 0.33)。此外,由于再生軸突的重新神經(jīng)支配,術(shù)后12周,用BMSC-ECM-NGs和SC-ECM-NGs治療的大鼠的靶肌肉的濕重始終顯著高于其他大鼠(圖8)。
圖8 | 胚胎干細(xì)胞移植后靶肌肉的再支配和濕重
綜上所述,這些結(jié)果證實(shí)BMSC-ECM-NG比其他ECM-NG組更好地介導(dǎo)軸突運(yùn)輸和傳導(dǎo)的顯著恢復(fù),同時(shí)增強(qiáng)神經(jīng)再生和進(jìn)一步的髓鞘再形成。
6.TMT標(biāo)記定量蛋白組-細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物形成的再生微環(huán)境分析
對(duì)植入10mm坐骨神經(jīng)缺損的自體移植物(對(duì)照組)和細(xì)胞外基質(zhì)BMSC-ECM修飾的神經(jīng)移植物2周后的再生神經(jīng)利用TMT蛋白組學(xué)檢測(cè)其蛋白表達(dá)譜。研究發(fā)現(xiàn)BMSC-ECM-NG無(wú)論在總的DEPs還是與神經(jīng)生長(zhǎng)、炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的DEPs上,與自體神經(jīng)之間的DEP數(shù)和表達(dá)差異最小。
圖9 | 細(xì)胞外基質(zhì)-神經(jīng)生長(zhǎng)因子形成的再生微環(huán)境分析。
● 研究結(jié)論
綜上所有結(jié)果表明,所有的細(xì)胞外基質(zhì)修飾的神經(jīng)移植物均有助于神經(jīng)再生,而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修飾的神經(jīng)移植物通過(guò)提供更有利的再生微環(huán)境獲得了更好的修復(fù)效果,即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修飾的神經(jīng)移植物誘導(dǎo)了神經(jīng)再生相關(guān)因子的高表達(dá),并表現(xiàn)出與自體神經(jīng)非常相似的低免疫原性。
小鹿推薦
鹿明生物具有豐富的蛋白組學(xué)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn),可以為您提供高質(zhì)量蛋白組學(xué)技術(shù)服務(wù)。
TMT標(biāo)記定量蛋白組技術(shù)是近些年比較熱門的蛋白組學(xué)定量技術(shù),主要具有一下優(yōu)勢(shì):
1、通量高:可一次性分析6、10、16、18個(gè)樣品
2、重復(fù)性好:所有樣品的分離鑒定條件一致
3、定量準(zhǔn)確:減少了樣本處理、以及不同組上機(jī)造成的實(shí)驗(yàn)誤差,因此能達(dá)到定量更準(zhǔn)確的效果
4、靈敏度高:可檢測(cè)到表達(dá)豐度為皮克(pg)級(jí)的蛋白。
文末看點(diǎn)
|lumingbio
在獲得AFADESI平臺(tái)原創(chuàng)團(tuán)隊(duì)全力支持下,截止2021年9月,鹿明生物已經(jīng)完成共計(jì)近千例樣本經(jīng)驗(yàn),包括心臟、腦、腫瘤、腸道、肝臟、腎臟、皮膚等十幾種組織樣本空間代謝組學(xué)檢測(cè)及分析,檢測(cè)物質(zhì)涵蓋膽堿類、多胺類、氨基酸類、肉堿類、核苷類、核苷酸類、有機(jī)酸類、碳水化合物類、膽固醇類、膽酸類、脂質(zhì)類等多種類代謝物。
猜你還想看
◆百萬(wàn)立項(xiàng)計(jì)劃 | 突破代謝組學(xué)化合物鑒定技術(shù)瓶頸:標(biāo)品庫(kù)管理背后的故事
◆Cancer cell | 樊嘉/周虎/高大明/高強(qiáng)又一力作:多組學(xué)聯(lián)合繪制肝內(nèi)膽管癌分子圖譜
◆R包不太冷之網(wǎng)絡(luò)圖繪制簡(jiǎn)單方法,你值得擁有!
End本文系鹿明生物原創(chuàng)