寫在前面

????????今天推薦的是由韓國成均館大學生物科學系在2020年4月28日發(fā)表于International Journal of Molecular Sciences（2020IF：5.923，JCRQ1/Q2）的一篇文章，通訊作者是Seok Hee Park教授，研究表明去泛素化酶USP20通過穩(wěn)定p62調(diào)節(jié)TNFα誘導的NF-κB信號通路。

研究背景

????????p62/sequestosome-1是一種支架蛋白，參與多種細胞過程，如自噬、氧化應激、細胞存活和死亡。已確定它與非典型蛋白激酶Cs(aPKCζs)相互作用，并將這些激酶與腫瘤壞死因子(TNFα)的NF-κB激活聯(lián)系起來。p62的多種功能是通過p62內(nèi)幾個結構域的翻譯后修飾來調(diào)節(jié)的。在介導這些翻譯后修飾的酶中，與參與p62泛素化的E3連接酶相比，人們對從p62中去除泛素鏈的去泛素化酶(DUB)知之甚少。

摘要部分

????????在這項研究中，作者首先證明了泛素特異性蛋白酶USP20在調(diào)節(jié)TNFα介導的NF-κB活化中p62穩(wěn)定性中的作用。USP20與p62特異性結合，并作為TNFα通過去泛素化賴氨酸48(K48)連接的多泛素化激活NF-κB的正調(diào)節(jié)劑，最終促進細胞存活。此外，USP20的敲低會破壞TNFα介導的NF-κB激活所需的非典型PKCζ-RIPK1-p62復合物的形成，并顯著增加由TNFα加放線菌酮或TNFα加TAK1抑制劑誘導的細胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)有力地表明，USP20-p62軸在由TNFα非典型PKCζ信號通路誘導的NF-κB介導的細胞存活中起重要作用。

研究內(nèi)容

1.USP20穩(wěn)定p62蛋白??? ?

????????以前，作者發(fā)現(xiàn)在泛素特異性蛋白酶20(USP20)敲低的HeLa細胞中，p62自噬銜接蛋白的表達顯示基礎水平略有下降，這表明USP20直接調(diào)節(jié)p62表達。為了驗證這種可能性，作者檢測了USP20敲低的HeLa細胞中p62 mRNA或蛋白質的表達。USP20敲低不影響p62 mRNA的水平，但顯著降低了p62蛋白的表達。免疫熒光分析還表明，HeLa細胞中USP20的敲低顯著降低了內(nèi)源性p62蛋白的表達。此外，HEK293細胞中USP20的以劑量依賴性增加了p62的表達。這些結果表明去泛素化酶USP20參與p62蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，而不是p62 mRNA水平的調(diào)節(jié)。

????????為了進一步證實這些結果，作者在蛋白質合成抑制劑放線菌酮(CHX)存在下檢查了p62蛋白的半衰期。在存在CHX的情況下，USP20在HeLa細胞中的過表達顯著增加了p62蛋白的半衰期以及p62的基礎水平，但USP20催化失活(CI)突變體（USP20- CI）的過表達沒有。此外，與對照HeLa細胞相比，去除USP20的HeLa細胞中p62蛋白的半衰期顯著縮短，并且基礎水平p62的穩(wěn)定性也受到影響。

研究結論：USP20穩(wěn)定了p62蛋白。

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2.USP20去泛素化p62K48-連接的多聚泛素化

????????為了了解USP20去泛素化酶活性在調(diào)節(jié)p62穩(wěn)定性中的重要性，作者首先檢查了USP20是否直接去泛素化p62。將編碼Flag-p62和HA-Ubi的質粒與WT USP20或USP20-CI共轉染到HeLa細胞后，進行了免疫沉淀和免疫印跡分析。WT USP20顯著降低了p62的多泛素化，而催化失活的突變體則沒有。HeLa細胞中的Ni-NTA下拉測定也顯示出類似的結果，支持USP20去除p62多泛素化。作者還探究了在蛋白質合成抑制劑放線菌酮(CHX)存在下p62蛋白的半衰期。在存在CHX的情況下，USP20在HeLa細胞中的過表達顯著增加了p62蛋白的半衰期，但USP20-CI的過表達沒有。此外，與對照HeLa細胞相比，去除USP20的HeLa細胞中p62蛋白的半衰期顯著縮短，基礎水平p62的穩(wěn)定性也受到影響。因此，這些結果表明USP20穩(wěn)定了p62蛋白。接下來，作者研究了USP20去泛素化p62的哪種多泛素化模式。作者發(fā)現(xiàn)p62的K48連接的多泛素化被USP20顯著去泛素化，但K63連接的多泛素化不受影響。

研究結論：USP20通過去泛素化K48連接的多泛素化鏈來調(diào)節(jié)p62的穩(wěn)定性。

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3.USP20是TNFα通過直接結合p62誘導NF-κB激活所必需的

????????作者發(fā)現(xiàn)USP20可以穩(wěn)定p62蛋白，這促使作者檢查USP20是否直接與p62結合。當編碼HA-USP20和Flag-p62的質粒在HeLa細胞中異位表達時，共免疫沉淀分析揭示了USP20與p62的直接相互作用。作者接下來檢查了TNFα處理后USP20與p62的內(nèi)源性相互作用。免疫沉淀分析支持在HeLa細胞中接受TNFα處理后USP20和p62之間的內(nèi)源性相互作用。這些結果使作者研究了USP20是否是TNFα誘導的NF-κB激活所必需的。USP20的異位表達增強了TNFα處理后NF-κB介導的報告基因活性，并增加了p62的表達。此外，實時定量RT-PCR分析顯示，在TNFα處理后，USP20敲低降低了NF-κB介導的靶基因的表達，這些基因與細胞存活相關。此外，在TNFα存在下，USP20敲低顯著降低了IKK/磷酸化并延遲了IB降解。

????????因為作者的研究結果表明USP20是通過靶向p62激活TNFα介導的NF-κB所必需的，作者接下來檢查了內(nèi)源性p62蛋白的去泛素化是否受USP20調(diào)節(jié)。與對照細胞相比，在TNFα處理后，USP20敲低的HeLa細胞在5分鐘時未觀察到多泛素化p62的減少，但內(nèi)源性p62的多泛素化模式增加，證明USP20是在TNFα介導的NF-κB激活中穩(wěn)定p62的正調(diào)節(jié)劑。通過與p62的相互作用，USP20可能是包括p62、PKCζ和RIPK1在內(nèi)的信號復合物的組成部分，用于TNFα誘導的NF-κB激活。為了驗證這種可能性，作者研究了USP20敲低是否會在TNFα處理后破壞由p62、PKCζ和RIPK1組成的信號復合物的形成。免疫沉淀分析顯示，PKCζ介導的信號復合物在USP20敲低的細胞中被破壞，表明USP20是TNFα中的關鍵成分-通過去泛素化和穩(wěn)定p62蛋白誘導NF-κB活化。

研究結論：USP20是TNFα通過直接結合p62誘導NF-κB激活所必需的。

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4.USP20敲低增加細胞凋亡

????????作者的結果表明USP20-p62軸負責PKCζ介導的NF-κB激活以促進細胞存活，因此USP20敲低可能會促進細胞死亡。為了驗證這種可能性，作者在TNFα加放線菌酮(CHX)存在下檢查了USP20敲低和對照HeLa細胞的細胞活力。使用TNFα/CHX的原因是因為哺乳動物細胞對TNFα的反應可以通過與CHX共同處理轉換為細胞凋亡。與表達siCON的對照細胞相比，在TNFα/CHX存在下，HeLa細胞中USP20的敲低顯著降低了細胞活力和細胞數(shù)量。在相同條件下，在p62敲低的HeLa細胞中也觀察到USP20敲低后的這種凋亡效應。此外，與對照HeLa細胞相比，在TNFα/CHX存在下，USP20敲低增加了裂解的caspase-8、caspase-3和PARP的表達，并導致這些裂解蛋白的基礎水平增加。FACS分析也顯示UPS20敲低導致NF-κB介導的RIPK1非依賴性細胞凋亡的增加。

????????接下來，作者探究了USP20敲低是否與RIPK1依賴性細胞凋亡有關。當RIPK1的磷酸化被TAK1缺陷或TAK1抑制劑（5Z-7）阻斷時，TNFα會促進RIPK1的激活，導致RIPK1依賴性細胞凋亡。與TNFα/CHX處理類似，在存在TNFα和5Z-7的情況下，HeLa細胞中USP20的敲低以及p62的敲低降低了細胞活力和細胞數(shù)量。免疫印跡分析地顯示，在用TNFα/5Z-7處理后，USP20敲低的HeLa細胞中裂解的caspase-8、caspase-3和PARP的表達增加。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明USP20的敲低，阻斷NF-κB介導的細胞存活，增加RIPK1依賴的細胞死亡。

研究結論：USP20敲低能夠增加細胞凋亡。

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結論與討論

????????總之，作者證明了PKCζ介導的NF-KB信號通路需要去泛素化酶USP20，通過在TNFα存在下穩(wěn)定p62支架蛋白。因此, 作者的數(shù)據(jù)定義了USP20在TNFα信號通路中對p62進行翻譯后修飾的新機制。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.mdpi.com/1422-0067/21/9/3116