6種黃酮協(xié)同抗氧化作用及構(gòu)效關(guān)系研究

肖星凝1徐雯慧1左 丹1廖 霞1明 建1,2

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

摘要：以ABTS+·清除能力為指標(biāo)，采用Chou-Talalay中效原理設(shè)計試驗，研究6種結(jié)構(gòu)不同的小分子黃酮協(xié)同抗氧化作用及構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明：6種黃酮化合物對ABTS+·清除能力依次為：5,6,7-三羥基黃酮>6-羥基黃酮>3,7-二羥基黃酮>5-羥基黃酮>3-羥基黃酮>7-羥基黃酮>抗壞血酸，其中5,6,7-三羥基黃酮、6-羥基黃酮和3,7-二羥基黃酮氧化作用效果顯著；在不同濃度下，兩種黃酮復(fù)配物對ABTS+·清除能力的聯(lián)合作用指數(shù)CI值有較大差異；3,7-二羥基黃酮和其它5種黃酮都有明顯的協(xié)同作用。充分說明6種黃酮化合物之間的協(xié)同抗氧化作用與化合物的羥基位置和數(shù)量有關(guān)，具有C3,7-二羥基是協(xié)同抗氧化作用的主要結(jié)構(gòu)特點。

關(guān)鍵詞：黃酮；抗氧化；構(gòu)效關(guān)系；相互作用；中效原理

黃酮類化合物是一類在植物界廣泛分布，具有酚羥基的兩個苯環(huán)(A環(huán)和B環(huán))通過一個三碳鏈相互連結(jié)而成的化合物[1]。依據(jù)C3是否呈環(huán)及其氧化程度和B環(huán)的連接位置等特點可將黃酮類化合物分為7個子類，即黃酮、類黃酮、黃酮醇、異黃酮、花色素、黃烷醇和查耳酮[2]。大量研究[3-5]表明，黃酮類化合物具有多種生理功能和藥用價值，如抗氧化、保護心腦血管、抗骨質(zhì)疏松作用、抗菌消炎、抗輻射和抗腫瘤等，其中最引人注目的是其抗氧化作用。據(jù)報道[6]，黃酮類化合物與其它抗氧化化合物(如單寧)的協(xié)同效應(yīng)可能是物質(zhì)高抗氧化活性的主要原因。

黃酮類化合物發(fā)揮其抗氧化作用主要是通過不同途徑防御引起機體氧化損傷的自由基，因而其抗氧化作用與其組分、結(jié)構(gòu)或聚合度都有密切關(guān)系[7]。當(dāng)前也有研究[8]涉及分析其結(jié)構(gòu)與抗氧化性的關(guān)系，但對黃酮類化合物協(xié)同抗氧化作用與構(gòu)效關(guān)系研究相對較少，仍需要進一步深入。然而食物中的抗氧化物質(zhì)發(fā)揮抗氧化作用往往是協(xié)同發(fā)揮作用的，但關(guān)于各種不同的黃酮之間如何發(fā)揮協(xié)同作用方面的研究還很少。本試驗擬選用3-羥基黃酮、5-羥基黃酮、6-羥基黃酮、7-羥基黃酮、3,7-二羥基黃酮和5,6,7-三羥基黃酮6種結(jié)構(gòu)不同的小分子黃酮作為研究對象，以抗壞血酸為對照，測定其抗氧化活性，并研究不同結(jié)構(gòu)黃酮兩兩復(fù)配后抗氧化活性的變化及怎樣復(fù)配才能產(chǎn)生協(xié)同抗氧化效應(yīng)，以探討抗氧化性與黃酮類化合物中取代基羥基的位置和數(shù)量的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-羥基黃酮、5-羥基黃酮、6-羥基黃酮、7-羥基黃酮、3,7-二羥基黃酮、5,6,7-三羥基黃酮、ABTS：生化試劑，美國Sigma公司；

其他試劑：分析純，成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：FA2004型，上海恒豐科學(xué)儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市易晨儀器制造有限公司；

分光光度計：JH722型，上海精科科學(xué)儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：85-2A型，金壇市科析儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ABTS+·清除率測定 根據(jù)文獻(xiàn)[9]，修改如下：將ABTS用2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液溶解，配成7 mmol/L ABTS儲備液，在室溫、避光條件下靜置12～16 h。將生成的ABTS+·溶液用磷酸鹽緩沖液(PBS，10 mmol/L，pH 7.4)稀釋至室溫下734 nm處吸光值為0.70±0.02，即得到ABTS+·工作液。將6種黃酮用無水乙醇配置濃度分別為5，10，15，20，30，40，50，60 μmol/L的溶液。反應(yīng)體系中，于10 mL試管中加入1 mL不同濃度的樣品液和3 mL ABTS+·工作液，混合均勻后30 ℃水浴反應(yīng)6 min，以抗壞血酸為對照，無水乙醇為空白，測定反應(yīng)液在734 nm處的吸光值m1，按式(1)計算樣品的ABTS+·清除率。然后計算出清除50% ABTS+·的濃度(IC50)。

(1)

式中：

c——ABTS+·清除率，%；

m1——樣品液吸光度；

m0——空白樣吸光度。

1.3.2 抗氧化相互作用試驗設(shè)計 根據(jù)6種黃酮化合物各自的IC50值，分別配置濃度為0.1，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5倍IC50值的溶液。兩個黃酮化合物復(fù)配，各個濃度均以等體積比混合均勻[如：0.5 mL 0.5(IC50)的化合物1與0.5 mL 0.5(IC50)的化合物2混合]，測定ABTS+·清除率。

1.3.3 化合物聯(lián)合作用指數(shù)分析 采用中效原理計算[10-12]。兩化合物聯(lián)合作用指數(shù)的公式為：

(2)

式中：

(D)1——化合物1與別的化合物聯(lián)合作用產(chǎn)生X效應(yīng)時所需的濃度；

(D)2——化合物2與別的化合物聯(lián)合作用產(chǎn)生X效應(yīng)時所需的濃度；

(Dx)1——化合物1單用產(chǎn)生X效應(yīng)時所需的濃度；

(Dx)2——化合物2單用產(chǎn)生X效應(yīng)時所需的濃度。

通過CI值可以定量判斷不同化合物間相互作用的性質(zhì)以及強度(表1)。衡量相互作用以平均CI值(Weighted Average CI，CIwt)表示，公式為：

(3)

式中：

CI50——在EC50(作用達(dá)到50%時的濃度)時的CI值；

CI75、CI90、CI95同理。

表1 化合物聯(lián)合作用的平均CI值區(qū)間及相互作用評價
Table 1 The range of CI and description in compound combination studies

1.3.4 統(tǒng)計分析 每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Excel 2010進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 6種黃酮的ABTS+·清除率

根據(jù)ABTS+·溶液前后吸光度的變化可測定樣品抗氧化能力[13]。3-羥基黃酮、5-羥基黃酮、6-羥基黃酮、7-羥基黃酮、3,7-二羥基黃酮、5,6,7-三羥基黃酮6種黃酮化合物ABTS+·清除率測定結(jié)果見圖1，其IC50值分別為：17.40，14.82，9.39，35.11，10.79，9.05 μmol/L，對照品抗壞血酸的IC50值為46.21 μmol/L，則其活性大小依次為：5,6,7-三羥基黃酮>6-羥基黃酮>3,7-二羥基黃酮>5-羥基黃酮>3-羥基黃酮>7-羥基黃酮>抗壞血酸。IC50越低，表明對 ABTS+·的清除能力越強，反之則越弱。綜合比較，6種黃酮化合物對 ABTS+·清除能力均強于抗壞血酸，其中5,6,7-三羥基黃酮清除能力最強，6-羥基黃酮較弱于5,6,7-三羥基黃酮，而3,7-二羥基黃酮，5-羥基黃酮，3-羥基黃酮，7-羥基黃酮顯著弱于5,6,7-三羥基黃酮，其中7-羥基黃酮最弱。

羥基數(shù)目和位置是影響黃酮類化合物抗氧化活性的重要因素，黃酮各環(huán)的羥基位點上，C3-OH、3′-OH、4′-OH是與自由基反應(yīng)的主要位點，C5-OH和C7-OH結(jié)構(gòu)能夠增強黃酮類化合物抗氧化活性[8]。然而羥基取代位置(主要是鄰二酚取代)對黃酮類化合物抗氧化作用的貢獻(xiàn)更大，酚羥基的數(shù)量并非越多越好[7]。如兒茶素B環(huán)上的鄰位酚羥基對ABTS+·清除能力的發(fā)揮起最重要作用，而A環(huán)和C環(huán)上的鄰位酚羥基貢獻(xiàn)很小[14]。本試驗結(jié)果6-羥基黃酮抗氧化活性大于3,7-二羥基黃酮也證明并非酚羥基的數(shù)量多抗氧化活性就越好。Zhang等[15]報道當(dāng)B環(huán)和/或A環(huán)有相鄰的-OH基團時可大大提高黃酮類化合物的抗氧化能力，此外由于不同黃酮化合物的結(jié)構(gòu)不同，它們在溶液中或水包油乳狀液中反應(yīng)表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。

2.2 6種黃酮兩兩復(fù)合物的抗氧化活性

由表2可知，當(dāng)兩種黃酮組合時，除了“5-羥基黃酮與3,7-二羥基黃酮”“6-羥基黃酮與3,7-二羥基黃酮”“3,7-二羥基黃酮與5,6,7-三羥基黃酮”3組以外，其他12個組合聯(lián)合作用時對ABTS+的清除效果都弱于它們單獨作用的?！?-羥基黃酮與3,7-二羥基黃酮”和“6-羥基黃酮與3,7-二羥基黃酮”在濃度小于0.75(IC50)時，聯(lián)合作用的清除率是小于兩個單獨作用或其中某一個單獨作用，大于0.75(IC50)時，則比單獨作用時效果都好。“3,7-二羥基黃酮與5,6,7-三羥基黃酮”則是從0.5(IC50)濃度開始聯(lián)合作用效果超過單獨作用。

圖1 6種黃酮化合物ABTS+·清除率(IC50值)
Figure 1 ABTS radical scavenging rates (IC50) of Six Different Flavonoids

表3是用中效原理算出各化合物聯(lián)合作用時的平均CI值，從表3中可看出，3,7-二羥基黃酮和其它5種黃酮聯(lián)合作用時都有或強或弱的協(xié)同作用(輕微協(xié)同，中等協(xié)同，協(xié)同)，與5-羥基黃酮、6-羥基黃酮和5,6,7,-三羥基黃酮聯(lián)合作用時，其CIwt為0.6～0.7，表現(xiàn)為協(xié)同作用，與7-羥基黃酮聯(lián)合作用時，CIwt為0.806，表現(xiàn)為中等協(xié)，與3-羥基黃酮聯(lián)合作用時CIwt為0.850，表現(xiàn)為輕微協(xié)同。6-羥基黃酮與5,6,7-三羥基黃酮組合時，CIwt為0.9～1.1，存在相加作用，而與其他黃酮(除3,7-二羥基黃酮以外)聯(lián)合作用時一般表現(xiàn)拮抗作用，與3-羥基黃酮表現(xiàn)為輕微拮抗，與5-羥基黃酮和7-羥基黃酮表現(xiàn)為中等拮抗。此外，表現(xiàn)為中等拮抗作用的還有5-羥基黃酮和5,6,7-三羥基黃酮中等拮抗，剩下的為拮抗?？傮w上，沒有出現(xiàn)強協(xié)同/拮抗或非常強協(xié)同/拮抗的組合。

抗氧化協(xié)同作用機理主要有修復(fù)再生、偶聯(lián)氧化、吸收氧氣、改變酶的活性、絡(luò)合金屬離子5大類[16]。許多研究證實多種抗氧化劑聯(lián)合使用效果往往要大于單一抗氧化劑的使用效果[17]，但是并非所有的抗氧化劑聯(lián)合使用就一定有很好的協(xié)同效果，還存在一些影響因素，如還原電位、相對濃度、反應(yīng)體系[18]。大多數(shù)情況下，在一個特定的比例，協(xié)同效應(yīng)達(dá)到最高水平[19]。湯曉等[20]認(rèn)為黃酮間的協(xié)同或拮抗可能需要在氧化壓力環(huán)境下才被激發(fā)。馬燕妮等[21]比較研究桑葉黃酮與鬼針草黃酮組分體外協(xié)同抗氧化活性時，表明在總黃酮量相同的情況下，分別提取后混合在一起對羥自由基的清除效果優(yōu)于混合提取，其原因可能是兩種原料放在一起提取，其中的化合物會發(fā)生相互反應(yīng)，從而使黃酮類成分含量減少。從本試驗也可看出單體黃酮的濃度和結(jié)構(gòu)對協(xié)同作用有一定影響。

表2 兩化合物組合對ABTS+·清除率和濃度的關(guān)系
Table 2 The relationship of ABTS+· clearance and concentration of two compounds in combination

表3 兩化合物復(fù)配清除ABTS+·的CI值
Table 3 The CI Value of two compound combinations on scavenging ABTS+·

2.3 黃酮協(xié)同抗氧化構(gòu)效關(guān)系

6種黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2，其不同點在于羥基數(shù)目和位置，這兩者是影響其抗氧化活性的重要因素。Wolfe等[22]曾報道B環(huán)具有苯鄰二酚基團的黃酮類和黃酮醇類化合物才有細(xì)胞抗氧化活性，其中具有3′,4′-鄰羥基基團具有很強的細(xì)胞抗氧化活性(CAA)，而5′-羥基基團降低CAA值，C-環(huán)結(jié)構(gòu)中，2,3-雙鍵、3-羥基基團、4-酮基基團均對CAA很重要。與單體相比，黃酮混合物的協(xié)同抗氧化所涉及的構(gòu)效關(guān)系更為復(fù)雜。Hidalgo等[23]認(rèn)為黃酮混合物抗氧化的協(xié)同作用與拮抗效果，可能與黃酮之間的氫鍵締合有關(guān)。Abou Samra等[24]研究表明，如果2種黃酮均有3’,4’-二羥基結(jié)構(gòu)，混合后容易生成鄰二苯醌結(jié)構(gòu)，其抗氧化活性會受到較強抑制。湯曉等[25]報道含有較多B環(huán)羥基的黃酮類化合物更易發(fā)生拮抗作用，可通過調(diào)節(jié)黃酮單品的比例減小混合物的拮抗作用或增強其協(xié)同作用。4-羰基與C2=C3對黃酮化合物抗氧化協(xié)同或拮抗作用的影響要大于3′,4′-鄰二羥基，而3′,4′-鄰二羥基的影響則大于B環(huán)僅有一個羥基的結(jié)構(gòu)[26]。

圖2 6種黃酮結(jié)構(gòu)
Figure 2 The structure of six flavonoids

由試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3,7-二羥基黃酮和其它5種黃酮聯(lián)合作用時都有或強或弱的協(xié)同作用(輕微協(xié)同，中等協(xié)同，協(xié)同)。其中，與5-羥基黃酮、6-羥基黃酮、7-羥基黃酮和5,6,7,-三羥基黃酮聯(lián)合作用表現(xiàn)為較強的協(xié)同作用，而與3-羥基黃酮卻表現(xiàn)出輕微協(xié)同作用關(guān)系?？梢钥闯鯝環(huán)上的C5,6,7位羥基比B環(huán)上的C3位羥基具有較強的協(xié)同作用，與3,7-二羥基黃酮具有較好的協(xié)同清除ABTS+·的效果；說明A環(huán)的C5—OH、C6-OH、C7-OH是高抗氧化活性基團結(jié)構(gòu)，這與Wolfe等[22]的研究結(jié)果基本一致。此外，單個羥基和3個羥基數(shù)目的黃酮之間均表現(xiàn)出拮抗作用(除6-羥基黃酮與5,6,7-三羥基黃酮表現(xiàn)出輕微相加作用外)。充分說明C3,7-二羥基是幾種黃酮協(xié)同抗氧化活性主要結(jié)構(gòu)特點。

3 結(jié)論

6種黃酮化合物對ABTS+·清除能力依次為：5,6,7-三羥基黃酮>6-羥基黃酮>3,7-二羥基黃酮>5-羥基黃酮>3-羥基黃酮>7-羥基黃酮>抗壞血酸，影響其抗氧活性主要因素是羥基化的程度和羥基的位置，但并非羥基取代基越多其抗氧化活性相對越強。對于6種黃酮化合物兩兩復(fù)合物協(xié)同抗氧化，化合物的結(jié)構(gòu)和濃度會影響復(fù)配后協(xié)同作用效果，本研究表明C3,7-二羥基是幾種黃酮協(xié)同抗氧化活性主要結(jié)構(gòu)特點，但是否通用于其它結(jié)構(gòu)類型黃酮有待進一步研究。對于兩黃酮化合物之間相互作用機制還有待于研究。本試驗只采用一種抗氧化方法對其抗氧化和協(xié)同抗氧化活性進行評價，在后續(xù)的研究中可以結(jié)合其它抗氧化活性評價方法，如細(xì)胞抗氧化活性和動物試驗等，進而全面評價其抗氧化活性和協(xié)同抗氧化作用，探索構(gòu)效關(guān)系，為抗氧化功能性食品配料的科學(xué)篩選提供依據(jù)。

The synergistic antioxidant effect and structure-activity relationship of six flavonoids

XIAO Xing-ning1XUWen-hui1ZUODan1LIAOXia1MINGJian1,2

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.ChongqingEngineeringResearchCenterofRegionalFood,Chongqing400715,China)

Abstract：In this study, the ABTS free radicals scavenging activity was as an indicator, the Chou-Talalay method was used to investigate the synergistic antioxidant effect and structure activity relationship of six kinds of small molecules with different structures. The results showed that the ABTS free radicals scavenging activity of the six kinds of flavonoids was in following order, i.e., 5,6,7-trihydroxy flavone > 6-hydroxyl flavone > 3,7-dihydroxy flavone > 5-hydroxy flavone > 3-hydroxy flavone > 7-hydroxyl flavone > ascorbic acid. Among them, 5,6,7-trihydroxy flavone, 6-hydroxy flavone and 3,7-dihydroxy flavone oxidation effect significantly, under different concentration and two flavonoid compounds on ABTS free radicals scavenging activity of the combined effect of CI values are quite different, dihydroxy flavone and other five kinds of flavonoids have obvious synergistic effect. It was also found that the synergistic antioxidant effects of the six flavonoid compounds were related to the position and quantity of the hydroxyl group, the main structural feature of the synergistic antioxidant effect of 3,7-dihydroxy.

Keywords：flavone; antioxidant; structure-activity relationship; interaction; Chou-Talalay method